השפעת אספירין ואיבופרופן על היכולת הפאגוציטית של מקרופאגים

תקציר

סרטון זה מציג שיטה להערכת ההשפעה של אספירין ואיבופרופן, בריכוזים המעכבים המינימליים שלהם, על מקרופאגים פגוציטוזה באמצעות תאים פטרייתיים מוכתמים בצבע פלואורסצנטי רגישים ל- pH. התרופות מעכבות ציקלואוקסיגנאז-2, מפחיתות את היווצרות הפרוסטגלנדינים ומגבירות את הפאגוציטוזה של המקרופאגים, כפי שנצפה באמצעות מדידות פלואורסצנטיות של צבע רגיש ל- pH.

פרוטוקול

1. שיקולי בטיחות

1. על אנשי הצוות להשתמש בציוד מגן אישי (PPE).
2. טפל בפתוגן ובמקרופאגים בארון בטיחות ביולוגי Class II.

2. הכנת מקרופאגים

1. טפחו קו תאי מקרופאג מורין, RAW 264.7, בבקבוק רקמה המכיל 10 מ"ל של Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) בינוני, בתוספת סטרפטומיצין 20 מ"ג/מ"ל, 2 mM L-גלוטמין, 20 U/mL פניצילין ו-10% סרום בקר עוברי (FBS).
2. הניחו את הבקבוק באינקובטור של 5% פחמן דו-חמצני (CO₂) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להשגת מפגש של 80%.
3. גרדו בעדינות את התאים באמצעות מגרד תאים.
4. מעבירים את התאים המרחפים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
5. השתמש בכתם הכחול טריפאן כדי לקבוע את כדאיות התא.
   הערה: עדיף ציון כדאיות מעל 85%.
   השתמש בהמוציטומטר כדי להתאים את ריכוז המקרופאגים בתאים ל- 1 × 10⁵ תאים / מ"ל באמצעות תמיסה של 10 מ"ל של מדיום סל"ד טרי וסטרילי. יש לפזר תרחיף של 100 μL של תאים לתוך בארות של צלחת מיקרוטיטר סטרילית בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות. יש לדגור על הצלחת למשך הלילה באינקובטור של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: יש לשאוף את המדיה ללילה ולהחליף אותה ב-100 מיקרוליטר של מדיה טרייה וסטרילית מסוג RPMI-1640 לפני השימוש.

3. הכנת תאים קריפטוקוקליים

1. פזרו את אורגניזם הבדיקה עם לולאת חיסון על צלחת אגר סטרילית של תמצית שמרים-לתת (YM).
2. דוגרים על צלחת האגר בטמפרטורה של 30°C למשך 48 שעות.
3. באמצעות לולאת חיסון, יש לחסן לולאה של תאים לתוך 100 מ"ל של מרק שמרים על בסיס חנקן (YNB) בתוספת 4% גלוקוז.
4. יש לגדל את התאים (טרום תרבית) למשך הלילה תוך כדי רעידות ב-160 סל"ד ב-30°C.
5. למחרת, לחסן 0.1 מ"ל של טרום תרבית לתוך מרק YNB טרי (תרבית עיקרית) ולאפשר לתאים לגדול עד השלב המעריכי האמצעי (תחת אותם תנאי גידול).
6. שטפו את התאים פעמיים עם תמיסת חיץ פוספט (PBS).
7. באמצעות המוציטומטר, סטנדרטיזציה של התאים ל 1 x 10⁵ ב PBS.

4. צביעה של תאים cryptococcal עם כתם phagocytosis

1. יש להוציא 999 מיקרוליטר מהתאים לתוך צינור פלסטיק בנפח 1.5 מ"ל.
2. הוסף 1 μL של כתם pHrodo green zymosan A לאותו צינור.
3. לדגור על התאים בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, בחושך, עם תסיסה איטית להגיב עם הכתם.
4. בסוף תקופת הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS.
5. יש לפזר תרחיף תאים של 100 μL לבארות המכילות מקרופאגים מזרעים.

5. הכנת תרופות

1. הכינו תמיסת אספירין ממקור באמצעות 1 מ"ג אספירין ב-1000 מ"ל אתנול מוחלט לריכוז סופי של 1000 מק"ג/מ"ל.
2. לדלל את התרכובת עוד יותר במדיה RPMI-1640 כדי להגיע לריכוזי התרופה הרצויה.
   הערה: הסכום הסופי של אתנול במדיה RPMI-1640 לא יעלה על 1%. הכן פתרון מלאי של איבופרופן באמצעות 1 מ"ג של איבופרופן ב 1000 מ"ל של dimethyl sulfoxide (DMSO). לדלל את התרכובת עוד יותר במדיה RPMI-1640 כדי להגיע לריכוזי התרופה הרצויה.
   הערה: הסכום הסופי של DMSO במדיה RPMI-1640 לא יעלה על 1%. הכינו תמיסה של 100 מיקרוליטר של התרופות המוכנות בריכוז כפול מהריכוזים הרצויים והזרימו לבארות מתאימות המכילות מקרופאגים זרעים ותאי קריפטוקוקל.

6. השפעת חומרים רגישים לכימותרפיה על מקרופאגים פגוציטוזה

1. יש לדגור על הצלחות עם תאים בתרבית משותפת בנוכחות חומרים רגישים לכימותרפיה, אספירין או איבופרופן באינקובטור של 5% CO₂ בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים או 6 שעות.
2. בסוף תקופת הדגירה, מדוד את הפלואורסצנטיות המושרה (לדוגמה: 492 ננומטר ו- em: 538 ננומטר).
   הערה: כתם ה-pHrodo מפליא רק בסביבות חומציות, כגון בתוך הפאגוזום.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגר	מרק		משמש להכנת צלחות YM
תמצית שמרים	מרק		משמש להכנת צלחות YM
תמצית לתת	מרק		משמש להכנת צלחות YM
פפטון	מרק		משמש להכנת צלחות YM
בסיס חנקן שמרים (YNB)	מעבדות דיפקו		משמש בטיפוח של תאים cryptococcal
גלוקוז	מרק		משמש להכנת צלחות YM
כתם כחול טריפאן	סיגמא-אולדריץ'		כדי למנות תאים חיים ומתים
תמיסת חיץ פוספט (PBS)	סיגמא-אולדריץ'		לשטוף ולדלל תאים
סל"ד- 1640 בינוני	ביוכרום		מצע טיפוח למקרופאגים
סרום בקר עוברי (FBS)	ביוכרום		משמש להשלמת מדיום RPMI-1640
פניצילין/סטרפטומיצין/L-גלוטמין	סיגמא-אולדריץ'		נוסף למדיום RPMI-1640
pHrodo green zymosan כתם	לייף טכנולוגיות		משמש להכתמת תאים מופנמים עקב שינוי ב- pH
חומצה אצטילסליצילית (אספירין)	סיגמא-אולדריץ'		התרופה שעומדת להיבדק
אתנול מוחלט	מרק		משמש להמסת אספירין
איבופרופן	סיגמא-אולדריץ'		תרופה להיבדק
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	מרק		משמש להמסת איבופרופן
לוחות מיקרוטיטר בעלי תחתית שטוחה 96 בארות	גריינר ביו-וואן		משמש ככלי שבתוכו בוצעו תגובות
בקבוק טישו	לאסק		משמש לטיפוח מקרופאגים
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל	לאסק		משמש להכלת מקרופאגים
גרוטאות תאים	לאסק		משמש לניתוק מקרופאגים מבקבוק הרקמה
לולאת חיסון	לאסק		משמש כדי לפזר תרבות על צלחת אגר
המוציטומטר	מריאנפילד		כדי לקבוע את ריכוז התא של המקרופאגים
1.5 מ"ל צינורות פלסטיק	מרק		משמש ככלי שבתוכו בוצעו תגובות
EZ Read 800 ספקטרופוטומטר מחקר	ביוכרום		כדי לקרוא את הצפיפות האופטית
Fluoroskan Ascent FL	תרמו-מדעי		כדי למדוד פלואורסצנטיות
חממת CO2	תרמו-פישר		משמש לדגירת המקרופאגים
ארון בטיחות ביולוגי סוג II	אסקו		כדי לעבוד בבטחה עם הפתוגנים מבלי לגרום נזק למשתמש.