שיטה immunofluorescence למדוד את נטרול של cytomegalovirus אנושי

תקציר

סרטון זה מדגים בדיקת immunofluorescence שנועדה למדוד את נטרול נגיף הציטומגלווירוס האנושי (HCMV). נוגדנים ספציפיים לווירוס מעורבבים עם הנגיף ומודגרים עם תאי פיברובלסט אנושיים. הנוגדנים מנטרלים את הנגיף, והופכים אותו ללא מסוגל להדביק את התאים המארחים, בעוד נגיפים שאינם מנוטרלים מדביקים את התאים. לאחר הדגירה, מידת הנטרול נקבעת על ידי כימות התאים הנגועים בנגיף באמצעות אימונופלואורסנציה.

פרוטוקול

1. הכנת תאי מטרה לזיהום

1. זרע תאי מטרה יום לפני ביצוע הניסוי בצלחת של 96 בארות (צלחת 'המטרה').
2. צלחת מספיק תאים לכל באר כדי להבטיח כמעט confluent (~ 90%) monolayer.
   הערה: הדבר תלוי בגודל היחסי של סוג תא היעד שלך. אם אתם משתמשים בפיברובלסטים של עורלה אנושית (HFFs), זרעו 20,000 תאים/באר.
3. בדרך כלל, יש לזרוע 21 בארות (7 למטה על 3 לרוחב) לכל דגימה, מה שמאפשר לנתח 4 דגימות לכל צלחת.
4. זרעו 12 בארות נוספות בכל צלחת (כלומר, שורה 8) שישמשו כבקרות.

2. הכנת הנגיף: תערובות נוגדנים

1. הוסף 90 μL של מדיה בשילוב עם נוגדנים (ומעורבב היטב) כדי ליצור ריכוז נוגדנים ראשוני כפול הרצוי לתוך 3 בארות של שורה 1 של צלחת 96 באר טרייה (צלחת 'דילול').
   הערה: ריכוז התחלתי טיפוסי של נוגדנים יהיה 20 מיקרוגרם/מ"ל אך יש לקבוע אותו אמפירית.
2. הוסף 60 μL של מדיה לכל אחת מ-18 הבארות שמתחתיה (כלומר, 6 למטה על 3 לרוחב) את 3 הבארות משלב 2.1.
3. הוסף 60 μL של מדיה ל -12 בארות נוספות (כלומר, שורה 8).
4. העברת 30 μL של דילול נוגדנים משורה 1 לבארות המתאימות בשורה 2.
5. ערבבו את התוכן של שורה 2 על ידי פיפטציה חלקה למעלה ולמטה 20 פעמים עם פיפטה רב ערוצית.
6. העברת 30 μL של דילול נוגדנים משורה 2 לשורה 3.
7. חזור על תהליך זה של ערבוב והעברה עד לערבוב התוכן של שורה 7.
8. לאחר ערבוב שורה 7, יש להשליך 30 μL מהבארות בשורה 7.
9. יש לדלל HCMV בתווך שלם כך ש-50 μL יכיל מספיק חלקיקים זיהומיים כדי לגרום לזיהום MOI=1 אם מוסיפים אותו ישירות לתאים.
   הערה: HCMV הוא פתוגן ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2). ודא שקיימים נהלי בטיחות נאותים והשתמש בעצות סינון עבור כל המדיה החשופה ל- HCMV.
   הערה: זה דורש את אותו מספר של חלקיקים זיהומיים כמו שיש תאים / באר, אשר ישתנה בהתאם לסוג התא ואת tropism וירוס. אם משתמשים ב- HFFs כמתואר לעיל, ריכוז הנגיף הנדרש הוא 4x10⁵ pfu/mL.
   הערה: ודא עודף מספיק של וירוס מדולל (למשל, 10% תוספת) מוכן.
10. הוסף 60 μL של מלאי וירוסים מדולל לכל הבארות המכילות דילול נוגדנים, ו 6 בארות המכילות רק 60 μL מדיה.
11. הוסף 60 μL של מדיה רק ל-6 בארות המדיה הנותרות בלבד, כדי לשמש כבקרות לא נגועות.
12. לדגור את הנגיף וכתוצאה מכך: תערובות נוגדנים ב 37^oC במשך 1 שעות.

3. זיהום של תאי מטרה

1. הסר את כל המדיה מתאי היעד.
2. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר 100 μL של וירוס: תערובת נוגדנים מצלחת 'דילול' אל התאים במיקום שווה ערך על צלחת 'המטרה'.
3. לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 24 שעות.

4. קיבוע תאים

1. הסרת כל המדיה מתאים.
   הערה: אין צורך להחליף טיפים בין בארות בשלב זה.
2. לשטוף את כל הבארות עם 200 μL פוספט buffered מלוחים (PBS) ולהסיר.
3. הוסף 180 μL -20 ^oC, 100% אתנול לכל הבארות.
4. לדגור צלחת ב -20 ^oC לפחות 30 דקות.
   הערה: ניתן להאריך שלב זה לחודש אחד לפחות, בתנאי שמוסיפים אתנול נוסף כשהוא מתחיל להתאדות.
   הערה: הצלחת בטוחה לטיפול בתנאי BSL-1 מנקודה זו ואילך, וניתן להשתמש בקצוות שאינם מסננים.

5. איתור תאים נגועים נגיפיים על ידי immunofluorescence (IF)

1. מוציאים אתנול מהצלחת.
2. לשטוף את כל הבארות עם 200 μL PBS ולהסיר.
3. מוסיפים 200 μL PBS לכל הבארות ודגרים במשך 5 דקות.
   1. בינתיים, להכין דילול נוגדנים ראשוני PBS.
   2. 100 μL של 1:2000 עכבר חד שבטי anti-IE יידרש לכל באר (הערה דילול הוא עבור נוגדן ספציפי הרשום בחומרים).
      הערה: דילול הנוגדן המשמש ל-IF עשוי להזדקק למיטוב אם נעשה שימוש בחלופה.
   3. תערובת מערבולת כדי להבטיח ערבוב מספיק.
4. הסר PBS מכל הבארות והוסף דילול נוגדנים ראשוני של 100 μL.
5. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.
6. הסר נוגדן ראשוני מכל הבארות.
7. מוסיפים 200 μL PBS ודגרים במשך 5 דקות.
   1. בינתיים, הכינו נוגדנים משניים ודילול 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב-PBS.
   2. 100 μL של 1:2000 IgG מצומד נגד עכבר פלואורופור ו 1 מיקרוגרם / מ"ל DAPI יידרשו לכל באר.
   3. הערה: ייתכן שיהיה צורך למטב דילול של נוגדנים משניים המשמשים עבור IF אם נעשה שימוש בחלופה.
   4. תערובת מערבולת כדי להבטיח ערבוב מספיק.
8. הסר PBS מכל הבארות והוסף 100 μL נוגדן משני / דילול DAPI.
9. יש לדגור על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, מוגנת מפני אור.
10. הסר נוגדן משני/DAPI מכל הבארות.
11. לשטוף את כל הבארות עם 200 μL PBS ולהסיר.
12. מוסיפים 200 μL PBS לכל הבארות ודגרים במשך 5 דקות.
13. הסר PBS והוסף PBS 100 μL לכל הבארות והאחסון, מוגן מפני אור, ב 4 ^oC עד מוכן image.
    הערה: ניתן לאחסן צלחות עד חודש עם אובדן מינימלי באיכות האות/תמונה.

6. הדמיה וספירה של תאים נגועים

1. כדי לכמת זיהום בקלות ובדייקנות, דמיינו לפחות 25% מכל באר, הן בערוץ הכחול (DAPI, גרעינים) והן בערוץ הנוגדנים המשני (HCMV immediate-early proteins (IE).
   הערה: האות שנוצר על ידי האימונופלואורסנציה IE צריך להיות דומה לזה של הצביעה הגרעינית ויש לבדוק תמונות כדי לאשר זאת.
2. זה יכול להתבצע באופן ידני, אבל השימוש במיקרוסקופ אוטומטי מומלץ.
   הערה: ההגדלה תהיה תלויה במכשיר שלך, אך מכיוון שמבנים גדולים (גרעינים) מצולמים, מטרות 4X/10X מספיקות בדרך כלל.
3. לאחר רכישת תמונות, עבד אותן באמצעות תוכנת ניתוח התוכנה הנבחרת.
   1. ראשית, זהה גרעינים באמצעות הערוץ הכחול, כדי לחשב את מספר התאים הנוכחים.
   2. רק אזורים אלה צריכים להיבדק עבור אות בערוץ האדום, כמו IE הוא חלבון מקומי גרעיני, כדי לחשב את מספר התאים הנגועים.
4. לאחר חישוב מספר התאים הנגועים ומספר התאים הכולל, חשב את אחוז הזיהום על בסיס באר.
5. ניתן לתקן ערכים אלה עבור רמות רקע של גילוי על ידי הפחתת אחוז הזיהום הממוצע שנצפה בבארות לא נגועות מכל הבארות האחרות.
   הערה: זה צריך להיות הרבה מתחת ל -1%. אם זה יותר מ 1%, הליך הניתוח דורש אופטימיזציה.
6. כעת ניתן להתוות, לחקור ולנתח ערכים מתוקנים אלה לפי הצורך.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכבר חד-שבטי נגד שיבוט נוגדנים IE 6F8.2	מיליפור	MAB8131	נוגדן ראשוני לאימונופלואורסנציה
ארנב נגד עכבר IgG, נוגדן מצומד אלקסה פלואור 568	Invitrogen	A-11061	נוגדן משני עבור immunofluoresence
מערכת WiScan® Hermes High Content Imaging	אידאה ביו-רפואית	-	מיקרוסקופ פלואורסצנטי אוטומטי בתפוקה גבוהה לכימות
תוכנת ניתוח תמונה Metamorph	התקנים מולקולריים	-	תוכנה לניתוח תמונות
בקרת איזוטיפ IgG1 אנושית	מרק	M5284	נוגדן בקרה לנטרול
8F9, נוגדן נגד HCMV גליקופרוטאין B	-	-	נוגדן מנטרל HCMV
דאפי	תרמו סיינטיפיק	62248	צביעת גרעיני התא
DMI4000B מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך	לייקה	-	מיקרוסקופ פלואורסצנטי המשמש לתמונות מייצגות