סרטון זה מדגים את בידוד החלבונים מנויטרופילים, אשר מעובד ומתעכל לפפטידים קטנים יותר. פפטידים אלה יכולים לשמש לניתוח עתידי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד ועיכול של חלבוני נויטרופילים
1.2K צפיות
⸱
15 בינואר 2026
במאמר זה
תקציר
פרוטוקול
1. איסוף תאי נויטרופילים וליזיס
- איסוף תאי HL60 ממוינים בנויטרופילים בצינור של 15 מ"ל על ידי דגימות צנטריפוגות במהירות של 400 x גרם למשך 5 דקות.
הערה: נויטרופילים צריכים להיות במפגש של 3.5 x 105 תאים / מ"ל לאחר התמיינות. קצרו כחמישה מיליון תאים למיצוי כולל של פרוטאום. - השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 15 מ"ל של תמיסה חוצצת פוספט (PBS) לתוך הצינור.
- דגימות צנטריפוגות ב 400 x גרם במשך 5 דקות.
- חזור על שלבים 1.2 עד 1.3.
הערה: ניתן להקפיא דגימות תאים במהירות הבזק עם חנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C לאחר שלב 1.4, בהתאם למסגרת הזמן של הניסוי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1. תהליך עבודה של תאי HL60 שהתמיינו לנויטרופילים לצורך יצירת פרופיל פרוטאומיקה מבוסס ספקטרומטריית מסות. קווי תאי HL60 בלתי ממוינים ומובחנים (באמצעות גירוי כימי DMSO) תורבתו, נאספו ועובדו למיצוי פרוטאום כולל. חלבונים עוכלו עם טריפסין/LysC, ופפטידים טוהרו באמצעות C18 STAGE-tips, ולאחר מכן זוהו על ידי LC-MS/MS. MaxQuant ו-Perseus שימשו לניתוח נתונים. איור שנוצר באמצעות Biorender.com
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
לא הוכרז על ניגוד עניינים.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 15 מ"ל שפופרת פלקון | VWR | 470225-000 | |
| 25 מ"ל סרולוגי | פישר סיינטיפיק | 14955235 | |
| אמוניום ביקרבונט (ABC) | תרמופישר סיינטיפיק | A643-500 | |
| אצטון | סיגמא אולדריץ' | 34850-1L | |
| ערכת בדיקת BSA | VWR | CA62408-940 | |
| צנטריפוגה 5810 R | סיגמא אולדריץ' | EP022628188 | |
| Dithiothreitol (DTT) | תרמופישר סיינטיפיק | ₪2000 | הכינו מלאי של 1M של אליציטוטים DTT ואחסנו בטמפרטורה של -20°C |
| סרום בקר עוברי (FBS) | תרמופישר סיינטיפיק | 12483020 | מפשירים, מכינים אליציטוטים ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C |
| בלוק חימום | |||
| HEPES | סיגמא אולדריץ' | H3375 | הכינו 8M Urea/40m HEPES aliquots, לאחסן בטמפרטורה של -20°C |
| יודואצטמיד (IAA) | פישר סיינטיפיק | AAA1471514 | הכינו מלאי של 0.55M של Aliquots של IAA ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. יש להימנע מחשיפה לאור |
| ל-גלוטמין | פישר סיינטיפיק | 25030081 | מפשירים, מכינים אליציטוטים ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C |
| חנקן נוזלי | |||
| צינורות מיקרוצנטריפוגות LoBind | אפנדורף | 13-698-794 | |
| פניצילין סטרפטומיצין, אמפוטריצין | סיגמא אולדריץ' | A5955 | מפשירים, מכינים אליציטוטים ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C |
| תאי HL60 ממוינים בנויטרופילים | |||
| תמיסה חוצצת פוספט (PBS) | ביושופ | PBS408 | יש לאחסן בטמפרטורת החדר |
| סוניק בדיקה | פישר סיינטיפיק | 100-132-894 | |
| טבלית קוקטייל מעכב פרוטאז (PIC) | סיגמא אולדריץ' | 5892791001 | יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C |
| RPMI 1640 | תרמופישר סיינטיפיק | 11875093 | יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C |
| סודיום דודציל סולפט (SDS) | תרמופישר סיינטיפיק | J18220. א1 | הכנת פתרון SDS 2% |
| צנטריפוגת SpeedVac | אפנדורף | 07-748-15 | |
| צלוחיות T75 | תרמופישר סיינטיפיק | 156499 | |
| טריס HCL pH 8.5 | פישר סיינטיפיק | BP152-1 | יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C |
| אמבטיה קולית | VWR | 97043-960 | |
| אוריאה | ביושופ | URE001.1 |
