הליך STAGE TIP להתפלה וטיהור של פפטידים

תקציר

סרטון זה מדגים טיהור פפטיד באמצעות הליך STAGE Tip. עמוד מיניאטורי המכיל חרוזי שרף הקשורים לשרשראות פחמימנים ארוכות מאפשר טיהור מבוסס אינטראקציה הידרופובית. עם העמסת דגימת פפטיד מעוכלת מראש לתוך העמודה, שברי הפפטיד נקשרים לחרוזי השרף, ומאפשרים לזיהומים לעבור דרכם. חיץ אלוציה המשבש את האינטראקציה ההידרופובית מוחל כדי להדק את שברי הפפטידים.

פרוטוקול

1. טיהור והתפלה של פפטידים

1. ארזו שלוש שכבות של שרף C18 בקצה פיפטה של 200 μl עבור כל דגימת פפטיד כדי לבנות קצה STop And Go Extraction (STAGE).
2. הוסף 1/10 תמיסת עצירה (20% אצטוניטריל [ACN)] ו-6% חומצה טריפלואורואצטית [TFA]) לדגימות.
3. דגימות צנטריפוגות למשקעים כדוריים ב-13,200 סל"ד למשך 10 דקות.
4. מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש של 2 מ"ל ומשליכים את הכדור.
5. יש לשטוף את קצוות הבמה עם 100 μl של 100% ACN.
6. קצוות שלב צנטריפוגה ב 1000 x גרם למשך 2 דקות
   הערה: צנטריפוגה STAGE טיפים עד שכל הנוזל עובר דרך שרף C18.
7. שטפו את קצוות STAGE עם 50 μl Buffer B (80% ACN, 0.5% חומצה אצטית ו-ddH₂O).
8. צנטריפוגה STAGE טיפים ב 1000 x גרם במשך 2 דקות.
9. שטפו את קצוות STAGE עם 200 μl Buffer A (2% ACN, 0.1% TFA, 0.5% חומצה אצטית ו-ddH₂O).
10. קצוות שלב הצנטריפוגות ב 1000 x גרם למשך 2 דקות.
11. טען דוגמאות לעצות STAGE.
12. דגימות צנטריפוגות ב 1000 x גרם במשך 3-5 דקות.
13. שטפו את קצוות STAGE עם 200 μl Buffer A.
14. צנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 3-5 דקות.
15. הוסף 50 μl של Buffer B לכל קצה STAGE
16. באמצעות מזרק, דגימות lute המכילות Buffer B לתוך צינור רצועת PCR 0.2 מ"ל
.
17. לאחר פליטת הדגימות, יבשו את הפפטידים באמצעות צנטריפוגת ואקום למשך 45 דקות.
18. לאחר שהדגימות יבשות, יש לאחסן אותן בטמפרטורת החדר עד MS.
    הערה: אם יש צורך באחסון פפטידים למשך יותר משבועיים, אנו ממליצים לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
19. הפעל את הדגימה בספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (MS).
    הערה: פרמטרי מדידת הדגימה (למשל, כמות הדגימה שנטענת, אורך שיפוע הכרומטוגרפיה הנוזלית, הרזולוציה) יהיו תלויים במכשור שבו נעשה שימוש.

2. פרופיל פרוטאומי של נויטרופילים

1. עיבוד נתונים גולמיים
   1. העלה קבצי נתונים גולמיים שהתקבלו מ- MS ל- MaxQuant.
   2. התוכנה נועדה לרוץ עם קבצי רכישה מלמטה למעלה, תלויי נתונים, ופרמטרים רבים כברירת מחדל מותאמים עבור דוגמאות כאלה. פרמטרי ברירת המחדל כוללים עיכול (טריפסין P), שינויים משתנים של חמצון מתיונין (חמצון (M)) ו-N-אצטילציה של חלבונים (אצטיל (חלבון N-term)), ושינויים קבועים של קרבמידומתילציה של ציסטאין (קרבמידומתיל (C)).
   3. התאמות לפרמטרים אלה כוללות כימות ללא תוויות (LFQ; הגדר ספירת יחס מינימלית ל- 1), התאמה בין ריצות (כלומר, הפעלה/כיבוי) ומספר מינימלי של פפטידים שזוהו לכל חלבון (מומלץ להגדיר ל- 2).
   4. בפרמטרים גלובליים, ייבא את קובץ FASTA לזיהוי רצף. לצורך ניסוי זה נעשה שימוש בקובץ FASTA של הומו ספיינס (אדם) (UP000005640) ממסד הנתונים של Uniprot. הערה: רשום את המידע הבא לשמירת רשומות: מזהה אורגניזם = 9606; מספר החלבונים = 79,740; תאריך הורדת הקובץ.
   5. הגדר את מספר ליבות המחשב שישמשו לעיבוד ובחר התחל.
   6. עם השלמת MaxQuant, תיווצר תיקייה 'משולבת', יחד עם קבצים אחרים.
      הערה: הקבצים האחרים עשויים לשמש לזיהוי פפטידים, שינויים וכו ', וייתכן שיהיה צורך להעלות את מערך הנתונים המלא למאגרי נתונים, כולל Proteome Xchange (PRIDE).
2. ניתוח נתונים והדמיה בפרסאוס
   1. העלה את 'proteingroups.txt' לפרסאוס ובחר את כל קבצי עוצמת LFQ עבור החלון 'ראשי'.
      הערה: מידע בסיסי מיובא ישירות לחלונות פרסאוס, אך ייתכן שיהיה צורך להוסיף מידע אחר (לדוגמה, אתרי שינויים) באופן ידני.
   2. סנן שורות על-ידי הסרת מזהמים, פפטידים הפוכים ופפטידים המזוהים רק לפי אתר.
   3. המר את הנתונים על-ידי יומן₂(x).
   4. כדי לבחון את מספר החלבונים שזוהו בכל שכפול, בנו דיאגרמת חיתוך קבוצות (Venn) מספרית.
   5. הגדר ביאורים קטגוריאליים עבור כל מדגם.
      הערה: למטרות סטטיסטיות, כל ההעתקים של מדגם ביולוגי אחד צריכים להיות בעלי שם זהה.
   6. סנן שורות בהתבסס על ערכים חוקיים, כאשר החלבון מזוהה ב->50% מהעותקים המשוכפלים ובתוך קבוצה אחת לפחות.
      הערה: סינון לפי ערכים תקפים יכול להיות מחמיר יותר, בהתאם למערך הניסוי ולמטרות (למשל, חלבון חייב להיות נוכח בכל הדגימות).
   7. כדי להחליף ערכים חסרים עבור LFQ, ניתן לבצע זקיפה מההתפלגות הנורמלית.
      הערה: פרמטרי ברירת המחדל ממוטבים לנתוני LFQ אך ניתן לכוונם כרצונך.
   8. הוסף מידע ביאור לשורות החלבון. הוסף את קובץ txt.gz FASTA (שהתקבל מאתר פרסאוס) בתיקיות 'bin', 'conf' ו- 'annotation' והוסף מונחים ספציפיים (למשל, שמות חלבונים, שמות גנים, אונטולוגיה של גנים).
   9. המטריצה הושלמה כעת וניתן להשתמש בה לבדיקות סטטיסטיות (למשל, ANOVA, בדיקות t) כדי לקבוע שינויים משמעותיים בשפע החלבונים בין התנאים שנבדקו. צורות אחרות של כלי תצוגה חזותית כוללות תרשימי ניתוח רכיבים עיקריים, מפות חום והעשרת קטגוריות.
      הערה: ניתן גם להוריד מידע ביאור מיוניפרוט ולשלב אותו במסגרת פרסאוס.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 מ"ל שפופרת פלקון	VWR	470225-000
25 מ"ל סרולוגי	פישר סיינטיפיק	14955235
אמוניום ביקרבונט (ABC)	תרמופישר סיינטיפיק	A643-500
חומצה אצטית	סיגמא אולדריץ'	1099510001
אצטון	סיגמא אולדריץ'	34850-1L
אצטוניטריל (ACN), כיתה MS	פירס	TS-51101
ערכת בדיקת BSA	VWR	CA62408-940
דיסקים C18 (עצות STAGE)	פישר סיינטיפיק	13110019
צנטריפוגה 5810 R	סיגמא אולדריץ'	EP022628188
Dithiothreitol (DTT)	תרמופישר סיינטיפיק	₪2000	הכינו מלאי של 1M של אליציטוטים DTT ואחסנו בטמפרטורה של -20°C
סרום בקר עוברי (FBS)	תרמופישר סיינטיפיק	12483020	מפשירים, מכינים אליציטוטים ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C
HEPES	סיגמא אולדריץ'	H3375	הכינו 8M Urea/40m HEPES aliquots, לאחסן בטמפרטורה של -20°C
ספקטרומטר מסות ברזולוציה גבוהה	תרמופישר סיינטיפיק	726042
יודואצטמיד (IAA)	פישר סיינטיפיק	AAA1471514	הכינו מלאי של 0.55M של Aliquots של IAA ואחסנו בטמפרטורה של -20°C. יש להימנע מחשיפה לאור
ל-גלוטמין	פישר סיינטיפיק	25030081	מפשירים, מכינים אליציטוטים ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C
צינורות מיקרוצנטריפוגות LoBind	אפנדורף	13-698-794
MaxQuant	https://www.maxquant.org/
צינורות רצועת PCR	VWR	76318-802
פניצילין סטרפטומיצין, אמפוטריצין	סיגמא אולדריץ'	A5955	מפשירים, מכינים אליציטוטים ומאחסנים בטמפרטורה של -20°C
פרסאוס	https://www.maxquant.org/Perseus/
תמיסה חוצצת פוספט (PBS)	ביושופ	PBS408	יש לאחסן בטמפרטורת החדר
סוניק בדיקה	פישר סיינטיפיק	100-132-894
טבלית קוקטייל מעכב פרוטאז (PIC)	סיגמא אולדריץ'	5892791001	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C
RPMI 1640	תרמופישר סיינטיפיק	11875093	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C
סודיום דודציל סולפט (SDS)	תרמופישר סיינטיפיק	J18220. א1	הכנת פתרון SDS 2%
צנטריפוגת SpeedVac	אפנדורף	07-748-15
צנטריפוגת הטיית במה	סונציה	STC-V2
צלוחיות T75	תרמופישר סיינטיפיק	156499
חומצה טריפלואורואצטית	תרמופישר סיינטיפיק	85183
טריס HCL pH 8.5	פישר סיינטיפיק	BP152-1	יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C
טריפסין/LysC	תרמו פישר סיינטיפיק	A40009	aliquot ולאחסן ב -20°C
אמבטיה קולית	VWR	97043-960
אוריאה	ביושופ	URE001.1