A STAGE Tip Procedure for Desalting and Purification of Peptides

doi:10.3791/30918

Abstract

This video demonstrates peptide purification through the STAGE Tip procedure. A miniature column containing resin beads bonded to long hydrocarbon chains facilitates hydrophobic interaction-based purification. Upon loading a pre-digested peptide sample into the column, the peptide fragments bind to the resin beads, allowing impurities to pass through. An elution buffer that disrupts the hydrophobic interaction is applied to elute the peptide fragments.

Protocol

1. טיהור והתפלה של פפטידים

ארזו שלוש שכבות של שרף C18 בקצה פיפטה של 200 μl עבור כל דגימת פפטיד כדי לבנות קצה STop And Go Extraction (STAGE).
הוסף 1/10 תמיסת עצירה (20% אצטוניטריל [ACN)] ו-6% חומצה טריפלואורואצטית [TFA]) לדגימות.
דגימות צנטריפוגות למשקעים כדוריים ב-13,200 סל"ד למשך 10 דקות.
מעבירים את הסופרנאטנט לצינור חדש של 2 מ"ל ומשליכים את הכדור.
יש לשטוף את קצוות הבמה עם 100 μl של 100% ACN.
קצוות שלב צנטריפוגה ב 1000 x גרם למשך 2 דקות
הערה: צנטריפוגה STAGE טיפים עד שכל הנוזל עובר דרך שרף C18.
שטפו את קצוות STAGE עם 50 μl Buffer B (80% ACN, 0.5% חומצה אצטית ו-ddH₂O).
צנטריפוגה STAGE טיפים ב 1000 x גרם במשך 2 דקות.
שטפו את קצוות STAGE עם 200 μl Buffer A (2% ACN, 0.1% TFA, 0.5% חומצה אצטית ו-ddH₂O).
קצוות שלב הצנטריפוגות ב 1000 x גרם למשך 2 דקות.
טען דוגמאות לעצות STAGE.
דגימות צנטריפוגות ב 1000 x גרם במשך 3-5 דקות.
שטפו את קצוות STAGE עם 200 μl Buffer A.
צנטריפוגה ב 1000 x גרם במשך 3-5 דקות.
הוסף 50 μl של Buffer B לכל קצה STAGE
באמצעות מזרק, דגימות lute המכילות Buffer B לתוך צינור רצועת PCR 0.2 מ"ל
לאחר פליטת הדגימות, יבשו את הפפטידים באמצעות צנטריפוגת ואקום למשך 45 דקות.
לאחר שהדגימות יבשות, יש לאחסן אותן בטמפרטורת החדר עד MS.
הערה: אם יש צורך באחסון פפטידים למשך יותר משבועיים, אנו ממליצים לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
הפעל את הדגימה בספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (MS).
הערה: פרמטרי מדידת הדגימה (למשל, כמות הדגימה שנטענת, אורך שיפוע הכרומטוגרפיה הנוזלית, הרזולוציה) יהיו תלויים במכשור שבו נעשה שימוש.

2. פרופיל פרוטאומי של נויטרופילים

עיבוד נתונים גולמיים
1. העלה קבצי נתונים גולמיים שהתקבלו מ- MS ל- MaxQuant.
2. התוכנה נועדה לרוץ עם קבצי רכישה מלמטה למעלה, תלויי נתונים, ופרמטרים רבים כברירת מחדל מותאמים עבור דוגמאות כאלה. פרמטרי ברירת המחדל כוללים עיכול (טריפסין P), שינויים משתנים של חמצון מתיונין (חמצון (M)) ו-N-אצטילציה של חלבונים (אצטיל (חלבון N-term)), ושינויים קבועים של קרבמידומתילציה של ציסטאין (קרבמידומתיל (C)).
3. התאמות לפרמטרים אלה כוללות כימות ללא תוויות (LFQ; הגדר ספירת יחס מינימלית ל- 1), התאמה בין ריצות (כלומר, הפעלה/כיבוי) ומספר מינימלי של פפטידים שזוהו לכל חלבון (מומלץ להגדיר ל- 2).
4. בפרמטרים גלובליים, ייבא את קובץ FASTA לזיהוי רצף. לצורך ניסוי זה נעשה שימוש בקובץ FASTA של הומו ספיינס (אדם) (UP000005640) ממסד הנתונים של Uniprot. הערה: רשום את המידע הבא לשמירת רשומות: מזהה אורגניזם = 9606; מספר החלבונים = 79,740; תאריך הורדת הקובץ.
5. הגדר את מספר ליבות המחשב שישמשו לעיבוד ובחר התחל.
6. עם השלמת MaxQuant, תיווצר תיקייה 'משולבת', יחד עם קבצים אחרים.
  הערה: הקבצים האחרים עשויים לשמש לזיהוי פפטידים, שינויים וכו ', וייתכן שיהיה צורך להעלות את מערך הנתונים המלא למאגרי נתונים, כולל Proteome Xchange (PRIDE).
ניתוח נתונים והדמיה בפרסאוס
1. העלה את 'proteingroups.txt' לפרסאוס ובחר את כל קבצי עוצמת LFQ עבור החלון 'ראשי'.
  הערה: מידע בסיסי מיובא ישירות לחלונות פרסאוס, אך ייתכן שיהיה צורך להוסיף מידע אחר (לדוגמה, אתרי שינויים) באופן ידני.
2. סנן שורות על-ידי הסרת מזהמים, פפטידים הפוכים ופפטידים המזוהים רק לפי אתר.
3. המר את הנתונים על-ידי יומן₂(x).
4. כדי לבחון את מספר החלבונים שזוהו בכל שכפול, בנו דיאגרמת חיתוך קבוצות (Venn) מספרית.
5. הגדר ביאורים קטגוריאליים עבור כל מדגם.
  הערה: למטרות סטטיסטיות, כל ההעתקים של מדגם ביולוגי אחד צריכים להיות בעלי שם זהה.
6. סנן שורות בהתבסס על ערכים חוקיים, כאשר החלבון מזוהה ב->50% מהעותקים המשוכפלים ובתוך קבוצה אחת לפחות.
  הערה: סינון לפי ערכים תקפים יכול להיות מחמיר יותר, בהתאם למערך הניסוי ולמטרות (למשל, חלבון חייב להיות נוכח בכל הדגימות).
7. כדי להחליף ערכים חסרים עבור LFQ, ניתן לבצע זקיפה מההתפלגות הנורמלית.
  הערה: פרמטרי ברירת המחדל ממוטבים לנתוני LFQ אך ניתן לכוונם כרצונך.
8. הוסף מידע ביאור לשורות החלבון. הוסף את קובץ txt.gz FASTA (שהתקבל מאתר פרסאוס) בתיקיות 'bin', 'conf' ו- 'annotation' והוסף מונחים ספציפיים (למשל, שמות חלבונים, שמות גנים, אונטולוגיה של גנים).
9. המטריצה הושלמה כעת וניתן להשתמש בה לבדיקות סטטיסטיות (למשל, ANOVA, בדיקות t) כדי לקבוע שינויים משמעותיים בשפע החלבונים בין התנאים שנבדקו. צורות אחרות של כלי תצוגה חזותית כוללות תרשימי ניתוח רכיבים עיקריים, מפות חום והעשרת קטגוריות.
  הערה: ניתן גם להוריד מידע ביאור מיוניפרוט ולשלב אותו במסגרת פרסאוס.

Disclosures

No conflicts of interest declared.

Materials

15 ml Falcon Tube	VWR	470225-000
25 mL Serological	Fisher Scientific	14955235
Ammonium Bicarbonate (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500
Acetic Acid	Sigma Aldrich	1099510001
Acetone	Sigma Aldrich	34850-1L
Acetonitrile (ACN), MS grade	Pierce	TS-51101
BSA assay kit	VWR	CA62408-940
C18 disks (STAGE tips)	Fisher Scientific	13110019
Centrifuge 5810 R	Sigma Aldrich	EP022628188
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Prepare 1M stock of DTT aliquots and store at -20°C
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Thaw out, prepare aliquots and stored at -20°C
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Prepare 8M Urea/40m HEPES aliquots, store at -20 °C
High-resolution mass spectrometer	ThermoFisher Scientific	726042
Iodoacetamide (IAA)	Fisher Scientific	AAA1471514	Prepare 0.55M stock of IAA aliquots and store at -20°C. Avoid light exposure
L-glutamine	Fisher Scientific	25030081	Thaw out, prepare aliquots and stored at -20°C
LoBind Microcentrifuge tubes	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://www.maxquant.org/
PCR strip tubes	VWR	76318-802
Penicillin Streptomycin, Amphotericin	Sigma Aldrich	A5955	Thaw out, prepare aliquots and stored at -20°C
Perseus	https://www.maxquant.org/Perseus/
phosphate-buffered solution (PBS)	Bioshop	PBS408	Store at room temperature
Probe sonicator	Fisher Scientific	100-132-894
Protease inhibitor cocktail (PIC) tablet	Sigma Aldrich	5892791001	Store at 4°C
RPMI 1640	ThermoFisher Scientific	11875093	Store at 4°C
Sodium Dodecyl Sulphate (SDS)	ThermoFisher Scientific	J18220.A1	prepare 2% SDS solution
SpeedVac Centrifuge	Eppendorf	07-748-15
STAGE tipping centrifuge	Sonation	STC-V2
T75 Flasks	ThermoFisher Scientific	156499
Trifluoroacetic acid	ThermoFisher Scientific	85183
Tris HCL pH 8.5	Fisher Scientific	BP152-1	Store at 4°C
Trypsin/LysC	Thermo Fisher Scientific	A40009	aliquot and store at -20°C
Ultrasonic bath	VWR	97043-960
Urea	Bioshop	URE001.1

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission