$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. בדיקת נטרול מבוססת פסאודוטיפ
NOTE: pMN הוא עיכוב של התמרה בתיווך נגיף פסאודוטיפ (PV) באמצעות דגימות נסיוב החלמה אנושי המכילות נוגדנים המכוונים נגד ספייק SARS-CoV-2.
- בצלחת לבנה של 96 בארות בעזרת פיפטה רב ערוצית, מוסיפים 50 μl של מדיום הנשר המתוקן של דולבקו (DMEM), 10% סרום בקר fetaval (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (Pen/Strep) לשורות B עד H, עמודות 1-12.
- הוסף סרה מחלימה של 5 μl לבארות בשורה A, עמודות 2-10, בנפח כולל של 100 μl DMEM/10% FBS/1% P/S. הוסף כמות ידועה (למשל, 5 μl) של חיובי (כיול NIBSC 20/162, HICC-pool 2 או HICC pool 3) ואנטיסרה שלילית (סרה מטופל שנלקחה לפני 2019) לבארות A11 ו- A12 כבקרות.
- הסר 50 μl מבארות שורה A ובצע דילול סדרתי כפול במורד כל הבארות שמתחתיה.
- עם כל שלב דילול, השתמש פיפטה רב ערוצית לערבב 5-10 פעמים על ידי pipeting למעלה ולמטה וזהירות לא לייצר בועות אוויר.
- לאחר השלמת הדילול הסדרתי, יש להשליך את 50 μl הסופי מהבאר הסופית של כל עמודה.
הערה: בשלב זה, כל באר צריכה להכיל 50 μl של DMEM מעורב ודילול סדרתי של סרה המטופל או סרה ביקורת.
- צלחת צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-500 סל"ד כדי להבטיח שלא יישאר נוזל על דפנות הבאר.
- באמצעות נתונים המתקבלים באמצעות טיטרציה פסאודוטייפ, חשב את כמות DMEM הנדרשת כדי לדלל את SARS-CoV-2 PV שלך כדי להשיג 5 x 106 RLU ב 50 μl, עם נפח כולל של 5 מ"ל.
- מערבבים את תמיסת ה-PV המדוללת הזו באגן פיפטה באמצעות פיפטה רב-ערוצית, ומזרימים 50 μl לכל באר בצלחת, למעט בארות A6-A12 (בקרת תאים בלבד). A1-A6 ישמש כבקרת PV בלבד.
- צלחת צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-500 סל"ד כדי להבטיח שלא יישאר וירוס על דפנות הבאר.
- לדגור על הצלחות במשך שעה אחת ב 37 ° C 5% פחמן דו חמצני (CO2), המאפשר זמן לסרום לקשור את הגליקופרוטאין SARS-CoV-2.
- הכינו צלחת של תאי מטרה HEK 293T/17 שהודבקו 24 שעות קודם לכן בפלסמיד ביטוי אנזים ממיר אנגיוטנסין 2 (ACE2) ופלסמיד סרין טרנסממברנה 2 (TMPRSS2) פלסמיד ביטוי.
- הוציאו את המדיה התרבותית מהצלחת.
- לשטוף את הצלחת פעמיים עם 2 מ"ל של PBS בצד אחד של הצלחת כדי למנוע ניתוק התא ולהשליך.
- מוסיפים 2 מ"ל טריפסין לצלחת ומכניסים את הצלחת לאינקובטור עד לניתוק התאים.
- לאחר ניתוק התאים, יש להוסיף 6 מ"ל DMEM/10% FBS/1% פניצילין/סטרפטומיצין לצלחת כדי להרוות את פעילות הטריפסין ולהשהות מחדש את התאים בעדינות.
- ספור תאים באמצעות TC20TM Automated Cell Counter או שקופית תא ספירה והוסף 1 x 104 תאים בנפח כולל של 50 μl לכל באר.
- לדגור על הצלחת במשך 48-72 שעות, ב 37 ° C, 5% CO2.
- קרא את הצלחת באמצעות מערכת הבדיקה Bright GloTM luciferase על לומנומטר Microplate Microplate של GloMax® Navigator על ידי הסרת מדיום התרבית מכל הבארות והוספת 25 μl של תערובת 1:1 של PBS: מגיב בדיקת Bright GloTM luciferase.
- מהנתונים הגולמיים המסופקים על ידי הלומינומטר, חשב את הריכוז המעכב החצי מקסימלי (IC50) המנטרל נוגדנים באמצעות פרוטוקולים מבוססים. ערכי IC50 מתחת לדילול 1:40 נחשבים שליליים. לחלופין, ניתן להעריך נתונים באמצעות AutoPlate.