הערכת נוגדנים מנטרלים פונקציונליים של SARS-CoV-2

תקציר

סרטון זה מציג בדיקת נטרול המודדת את יעילות הסרום בנטרול נגיפי SARS-CoV-2. הוא כולל וירוסים פסאודוטייפים, דילול בסרום וכימות מבוסס לומינסנציה, החושף את טיטר הניטרול.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. בדיקת נטרול מבוססת פסאודוטיפ

NOTE: pMN הוא עיכוב של התמרה בתיווך נגיף פסאודוטיפ (PV) באמצעות דגימות נסיוב החלמה אנושי המכילות נוגדנים המכוונים נגד ספייק SARS-CoV-2.

1. בצלחת לבנה של 96 בארות בעזרת פיפטה רב ערוצית, מוסיפים 50 μl של מדיום הנשר המתוקן של דולבקו (DMEM), 10% סרום בקר fetaval (FBS), 1% פניצילין/סטרפטומיצין (Pen/Strep) לשורות B עד H, עמודות 1-12.
2. הוסף סרה מחלימה של 5 μl לבארות בשורה A, עמודות 2-10, בנפח כולל של 100 μl DMEM/10% FBS/1% P/S. הוסף כמות ידועה (למשל, 5 μl) של חיובי (כיול NIBSC 20/162, HICC-pool 2 או HICC pool 3) ואנטיסרה שלילית (סרה מטופל שנלקחה לפני 2019) לבארות A11 ו- A12 כבקרות.
3. הסר 50 μl מבארות שורה A ובצע דילול סדרתי כפול במורד כל הבארות שמתחתיה.
4. עם כל שלב דילול, השתמש פיפטה רב ערוצית לערבב 5-10 פעמים על ידי pipeting למעלה ולמטה וזהירות לא לייצר בועות אוויר.
5. לאחר השלמת הדילול הסדרתי, יש להשליך את 50 μl הסופי מהבאר הסופית של כל עמודה.
   הערה: בשלב זה, כל באר צריכה להכיל 50 μl של DMEM מעורב ודילול סדרתי של סרה המטופל או סרה ביקורת.
6. צלחת צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-500 סל"ד כדי להבטיח שלא יישאר נוזל על דפנות הבאר.
7. באמצעות נתונים המתקבלים באמצעות טיטרציה פסאודוטייפ, חשב את כמות DMEM הנדרשת כדי לדלל את SARS-CoV-2 PV שלך כדי להשיג 5 x 10⁶ RLU ב 50 μl, עם נפח כולל של 5 מ"ל.
8. מערבבים את תמיסת ה-PV המדוללת הזו באגן פיפטה באמצעות פיפטה רב-ערוצית, ומזרימים 50 μl לכל באר בצלחת, למעט בארות A6-A12 (בקרת תאים בלבד). A1-A6 ישמש כבקרת PV בלבד.
9. צלחת צנטריפוגה למשך דקה אחת ב-500 סל"ד כדי להבטיח שלא יישאר וירוס על דפנות הבאר.
10. לדגור על הצלחות במשך שעה אחת ב 37 ° C 5% פחמן דו חמצני (CO₂), המאפשר זמן לסרום לקשור את הגליקופרוטאין SARS-CoV-2.
11. הכינו צלחת של תאי מטרה HEK 293T/17 שהודבקו 24 שעות קודם לכן בפלסמיד ביטוי אנזים ממיר אנגיוטנסין 2 (ACE2) ופלסמיד סרין טרנסממברנה 2 (TMPRSS2) פלסמיד ביטוי.
    1. הוציאו את המדיה התרבותית מהצלחת.
    2. לשטוף את הצלחת פעמיים עם 2 מ"ל של PBS בצד אחד של הצלחת כדי למנוע ניתוק התא ולהשליך.
    3. מוסיפים 2 מ"ל טריפסין לצלחת ומכניסים את הצלחת לאינקובטור עד לניתוק התאים.
    4. לאחר ניתוק התאים, יש להוסיף 6 מ"ל DMEM/10% FBS/1% פניצילין/סטרפטומיצין לצלחת כדי להרוות את פעילות הטריפסין ולהשהות מחדש את התאים בעדינות.
    5. ספור תאים באמצעות TC20^TM Automated Cell Counter או שקופית תא ספירה והוסף 1 x 10⁴ תאים בנפח כולל של 50 μl לכל באר.
12. לדגור על הצלחת במשך 48-72 שעות, ב 37 ° C, 5% CO₂.
13. קרא את הצלחת באמצעות מערכת הבדיקה Bright Glo^TM luciferase על לומנומטר Microplate Microplate של GloMax® Navigator על ידי הסרת מדיום התרבית מכל הבארות והוספת 25 μl של תערובת 1:1 של PBS: מגיב בדיקת Bright Glo^TM luciferase.
14. מהנתונים הגולמיים המסופקים על ידי הלומינומטר, חשב את הריכוז המעכב החצי מקסימלי (IC50) המנטרל נוגדנים באמצעות פרוטוקולים מבוססים. ערכי IC50 מתחת לדילול 1:40 נחשבים שליליים. לחלופין, ניתן להעריך נתונים באמצעות AutoPlate.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קצוות פיפטה MultiGuard Barrier 1-20 μl	סורנסון ביוסיינס	30550T
קצוות פיפטה MultiGuard Barrier 1-200 μl	סורנסון ביוסיינס	30550T
NuncTM צלחת תרבית תאים דלתא משטח מטופל (10 ס"מ כלים סטריליים)	תרמו פישר סיינטיפיק	150350
אגני פיפטה (50 מ"ל)	כללי
צלחת לבנה 96 בארות	תרמו פישרסיינטיפיק	136101
תאי HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
פלסמיד ביטוי קולטן כניסת תאי מארח אנזים ממיר אנגיוטנסין 2 (ACE2): pCDNA3.1+-ACE2			סימונס 2004
Coronavirus Spike (S) protein priming transmembrane serine protease 2 (TMPRSS2) פלסמיד ביטוי: pCAGGS-TMPRSS2			ברטרם 2010
מדיום Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco עם 4.5 גרם / ליטר גלוקוז, בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו -1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S)	פאן-ביוטק	P04-04510 P40-37500 פ06-07100
מגיב FuGENE® HD Transfection, 1 מ"ל	פרומגה	E2311
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום	פאן-ביוטק	פ10-040100
נוגדן בקרה חיובי (מגיב מחקר עבור Anti-SARS-CoV-2 Ab) שיכול לנטרל את SARS-CoV-2 PV (NIBSC, קוד: 20/162, זמין בינלאומית או HICC-pool 2 / HICC pool 3)
פלסמת החלמה אנושית של COVID-19 לבדיקה
מערכת בדיקת Glo luciferase	פרומגה	E2650

בהירה