בדיקות להערכה איכותית וכמותית של ריכוזי גלוקוז בשתן עכברים

תקציר

סרטון זה מדגים הליך לאיסוף שתן עכבר והערכת רמות הגלוקוז שלו. כדי להעריך את רמת הגלוקוז, לטבול רצועת בדיקה מצופה אנזימים וצבע כרומוגני לתוך הדגימה, ליזום שינוי צבע המציין את רמות הגלוקוז. לכימות רמות הגלוקוז בשתן, יש להכניס דגימת שתן לצלחת מרובת בארות עם ריכוזי גלוקוז עולים, להוסיף את תערובת התגובה ולדגור. למדוד את הספיגה כדי ליצור עקומה סטנדרטית ולחשב את רמות הסוכר בהתבסס על ספיגת הדגימה.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בדיקת גלוקוז נקודתית בשתן

1. מניחים פיסת פרפילם נקייה על משטח שטוח.
2. הרימו בעדינות עכבר בזנב והניחו אותו על הפרפילם.
3. רסן את העכבר באמצעות האגודל והאצבע המורה. הרימו בעדינות את העכבר בעודו מרוסן בשפשוף, מה שגרם לעכבר להשתין כתגובת לחץ. אפשר לטיפת שתן ליפול על משטח הפרפילם. להחזיר את העכבר לכלוב שלו לאחר איסוף טיפת השתן.
4. טבלו את הקצה המגיב של רצועת דיאסטיקס בטיפת השתן הטרייה שנאספה על משטח הפרפילם. הסר את הרצועה מיד והנח אותה שטוחה על משטח עם צד הצבע כלפי מעלה. המתינו לפחות 30 שניות עד שצבע יתפתח על הרצועה במלואו. השווה את הצבע שפותח עם תרשים הייחוס המסופק במכל Diastix (איור 1).
   טיפים: אם העכבר אינו משתין על הפרפילם, הפעל לחץ עדין על הבטן התחתונה של העכבר (סביב שלפוחית השתן) באמצעות האצבע המורה. גישה זו תסייע לשחרר טיפות שתן על הפרפילם. עבור עכברים שאינם משתינים לאחר ביצוע ההליך המתואר לעיל, המתן 20 דקות והתחל את ההליך שוב. ודא שכל ההליכים מתבצעים תוך שמירה על הנחיות IACUC.

2. איסוף שתן של 24 שעות באמצעות כלוב מטבולי של עכבר

1. הרכיבו כלוב מטבולי Tecniplast (איור 2) בהתאם להוראות היצרן.
2. מלאו את מכלול ההזנה באבקת צ'או ולאחר מכן חברו את מכלול ההזנה ללשונית המתכת המתאימה בתא העליון.
3. קבע את תמיכת בקבוק המים על לשונית המתכת הנותרת בתא העליון.
4. מלא את בקבוק המים הריק ולאחר מכן החלק אותו לתוך תמיכת הבקבוק, ודא שצינור הלוגם נמצא בתוך החור.
5. שים עכבר בכלוב חילוף החומרים ולאחר מכן לכסות אותו עם מכסה.
6. ודא שמכסה הכלוב מותאם כראוי.
7. מקם צינור איסוף שתן וצינור איסוף צואה במקומות המתאימים להם בקומת החדר התחתון.
8. לאחר 24 שעות, אחזר את צינור איסוף השתן ובצע בדיקת גלוקוז כדי לקבוע את ריכוז הגלוקוז בשתן. אם בדיקת הגלוקוז אינה מבוצעת באותו יום, יש להקפיא את דגימת השתן במקפיא של -80°C.

3. קביעת 24 שעות שתן ריכוז גלוקוז

1. אם דגימת השתן מאוחסנת בטמפרטורה של -80°C, יש לתת לדגימה להפשיר לפני ביצוע בדיקת גלוקוז.
2. ממלאי של 100 מ"ג/ד"ל, הכינו שמונה תקנים החל מ-25 מ"ג/ד"ל ועד 0 מ"ג/ד"ל בהתאם להוראות ערכת המבחן.
3. הכינו בארות סטנדרטיות ובארות דגימת שתן בצלחת של 96 בארות, והכל בכפילויות, על פי מדריך הערכה.
4. לאחר התחלת התגובה על ידי הוספת הכמות המומלצת של תערובת אנזימים לכל הבארות, מכסים את הצלחת ומניחים לה לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
5. ספיגת קריאה ב-500-520 ננומטר באמצעות קורא לוחות.
6. נתח את הנתונים בהתאם להוראות ערכת הבדיקה. התווה את הספיגה של כל תקן לעומת ריכוז הגלוקוז והשתמש בגרף כדי לקבוע את ריכוז הגלוקוז של דגימת השתן של 24 שעות.

תוצאות

איור 1. בדיקת גלוקוז נקודתית בשתן. טיפות השתן של העכבר שנאספו על Parafilm ותרשים ייחוס הצבעים שסופק על מיכל Diastix.

איור 2. כלוב מטבולי Tecniplast לאיסוף שתן עכבר 24 שעות. עכבר שוכן לבדו בכלוב זה כדי לאסוף שתן 24 שעות.