כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת חלבון האנטיגן MRSA HI
- להשיג שיבוטים של גורם B (IsdB) ומוטנט α-המוליזין (Hla) ממקורות מסחריים (ראה טבלת חומרים), לבצע הגברה של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי להגביר את הגנים IsdB ו-Hla, ולשייך את מוצריהם לפלסמיד PGEX-6P-2 (המתקבל באופן מסחרי; ראה טבלת חומרים). מסך עם זן Xl/כחול וקטורי של Escherichia coli.
- הפוך את השיבוט החיובי לתאים מוכשרים של E. coli BL21 (ראה טבלת חומרים) והגבר באמצעות תרבית כרישים.
- בטא את האנטיגן ובודד לאחר אינדוקציה באמצעות ערכות איזופרופיל-β-D-1-מרקפטוגלקטופיראנוסיד וכרומטוגרפיה רב-מודאלית (MMC) (ראה טבלת חומרים).
- לאפיין את חלבון האנטיגן ולטהר אותו עם מטהר אוטומציה מלאה.
- חלבונים מתויגים ב-Affinity-purify gutathione S-transferase (GST) מליזטים מנוקים באמצעות שרף כרומטוגרפיית זיקה זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).
- לטהר את החלבונים הרקומביננטיים על ידי isopropyl-β-D-1-mercaptogalactopyranoside וכרומטוגרפיה multimodal (MMC).
- הסר את האנדוטוקסין בשיטת הפרדת הפאזה Triton X-114. בקצרה, יש לערבב 1% Triton X-114 עם חלבון רקומביננטי בטמפרטורה של 0°C למשך 5 דקות כדי להבטיח תמיסה הומוגנית, ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות כדי לאפשר היווצרות של שני שלבים.
- השתמש בשיטת בדיקת אנדוטוקסין חיידקי עם ערכות צבים (ראה טבלת חומרים) כדי לזהות את ריכוז האנדוטוקסין. האנדוטוקסין לאנטיגן חלבוני הוא 0.06 EU/μg, נמוך מהתקן הבינלאומי (1.5 EU/μg).
- בצע בדיקת הפרעה כדי למנוע את ההשפעה האפשרית של מוצר הבדיקה על זיהוי אנדוטוקסין.
הערה: על פי נספח 2020 של הפרמקופיאה הסינית, תכולת האנדוטוקסין צריכה להיות פחות מ -5 האיחוד האירופי למנה. הרגישות של לימולוס ליזט (λ0.25 EU/mL) ויחס הדילול האפקטיבי המרבי של 33.3 חושבו על בסיס דילול תקף מרבי, MVD = cL/λ, כאשר L הוא ערך הגבול של אנדוטוקסין חיידקי עבור מאמר הבדיקה, c הוא הריכוז של תמיסת מאמר הבדיקה, וכאשר L מבוטא ב- EU/m, c שווה ל 1.0 מ"ג / מ"ל. λ היא הרגישות המסומנת (EU/mL) של מגיב סרטן הפרסה בשיטת הג'ל.
- שלב מחדש את האנטיגן (48 kDa, נקבע על ידי 12% נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה [SDS-PAGE]) ב 1.5 מ"ג / מ"ל במים סטריליים ללא אנדוטוקסין או מלוחים חוצצים פוספט (PBS) (שיטת נתרן dichlorate).
הערה: זמן שיא החלבון היה 13.843 דקות, הטוהר היה 99.4% (שיטת כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים), והחלבון אוחסן ב -70 מעלות צלזיוס. DNA גנומי שהופק מזן S. aureus MRSA252 (ראה טבלת חומרים) שימש כתבנית PCR. הגן IsdB הוגבר באמצעות פריימר קדמי 59-CGCGGATCCATGAATGGCGAAGCAAAAGCAG
C-39 והפריימר ההפוך 59-TTTTCCTTTTGCGG
CCGCCTATGTCATATCTTTATTAGATTCTC-39.
הגן Hla הוגבר באמצעות פריימר קדמי PHLAF (GCGGATCCGATTCTGATTATTATATTAAAACC) והפריימר ההפוך PHLAR (TAAGCGGCCGCTTATCAATTTGTCATTTCTCTTC).
2. הכנת חיסון ננו-תחליב
- לפי יחס המסה של 1:6:3 (w/w), יש להוסיף שלושה סוגים של חומרים פעילים ברצף (איזופרופיל מיריסטט, שמן קיק פוליאוקסאתילן ופרופילן גליקול; ראו טבלת חומרים) לתמיסת חלבון האנטיגן HI (10 מ"ג/מ"ל) ולערבב היטב. לאחר מכן, הוסיפו מים טהורים מעוקרים בהדרגה כדי להגיע לנפח סופי של 10 מ"ל וערבבו במהירות של 500 סל"ד ו-25°C במשך כ-20 דקות
הערה: ננו-תחליב שהוכן בפרוטוקול זה הוא בעל נפח של 10 מ"ל, והמסות של שלושת החומרים הפעילים הן 0.34 גרם, 2 גרם ו-1 גרם, בהתאמה. הפתרון החלבוני כאן הוא פתרון העבודה, פי 10 מהריכוז של התמיסה הסופית.
- הכן את החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב (1 מ"ג / מ"ל חלבון) בשיטות תחליב באנרגיה נמוכה כדי להשיג תמיסה נוזלית ברורה ושקופה.
הערה: הננו-תחליב הריק (BNE) הוכן בשיטות דומות, אלא שהמים הוחלפו ב-HI. שיטת התחליב הרגילה כוללת חימום הפאזה החיצונית והפנימית לכ-80 מעלות צלזיוס לצורך תחליב ולאחר מכן ערבוב וקירור הדרגתיים. בתהליך זה, כמות גדולה של אנרגיה נצרכת, ולבסוף, תחליב מתקבל.
3. אפיון פיזי ויציבות של החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב
- גודל חלקיקים, פוטנציאל זטה ואפיון אינדקס פיזור פולימרים (PDI).
- הכינו 100 μL של החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב ודללו פי 50 במים להזרקה. הוסף 2 מ"ל של מדגם לאיתור.
- התבונן בגדלי החלקיקים, פוטנציאל הזטה וה-PDI ב-25°C באמצעות ננו-זטסייזר (ZS; ראה טבלת חומרים).
- מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)
- לדלל 10 μL של חיסון ננו-תחליב 50 פעמים עם מים, להניח על רשת נחושת מצופה פחמן 100-mesh, ולהכתים עם 1% חומצה phosphotungstic (ראה טבלה של חומרים) במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר תמיסת חומצה פוספוטונגסטית עודפת עם נייר סינון.
- התבוננו במורפולוגיה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (ראו טבלת חומרים). בדקו האם המוצרים המוגמרים כמעט יציבים ומעגליים בתוך שדה הראייה של מיקרוסקופ האלקטרונים והאם הם מפגינים פיזור טוב.
- מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM)
- לדלל 10 μL של החיסון האדג'ובנטי ננו-תחליב פי 50 עם מים, להטיל 10 μL של דגימות מדוללות מראש על פרוסת סיליקון, ומניחים באינקובטור מבוקר תרמוסטט 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
- מרססים את הפלטינה המוכנה על הסיליקון למשך 40 שניות ומצננים לטמפרטורת החדר.
- התבונן בתכונות המורפולוגיות של הדגימות המוכנות תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים). קבע אם הדגימות כמעט יציבות, כדוריות ומפוזרות היטב בשדה הראייה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים.
- יציבות מורפולוגית
- מניחים 1 מ"ל של דגימות חיסון ננו-תחליב בצינורות מיקרוצנטריפוגה, ומעריכים את יציבות הדגימות הטריות על ידי צנטריפוגה במשך 30 דקות ב 13,000 x גרם בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס).
- שימו לב להופעתן של דגימות טריות אלה ולאחר מכן בצעו בדיקת יציבות תרמודינמית של שישה מחזורי טמפרטורה (מחזור אחד: אחסנו בטמפרטורה של 4°C למשך 48 שעות, 25°C במשך 48 שעות ו-37°C במשך 48 שעות).
- לאחר הצנטריפוגה, יש לאפשר לדגימות לעמוד במשך 15 דקות כדי לקבוע אם קיים אפקט טינדל (האם הדגימה שקופה ושקופה תחת אור) ואם התרחשה דה-מולסיפיקציה (מוצג על ידי ריבוד ברור לאחר הדחה).
- SDS-PAGE וכתם מערבי
- נערו את הדגימות, ערבבו תמיסה של 0.6 מ"ל אתנול מוחלט ו-0.3 מ"ל חיסון, וצנטריפוגה (13,000 x גרם, 30 דקות בטמפרטורת החדר, 25 מעלות צלזיוס).
- מעבירים את הסופרנאטנט של התמיסה לצינור נקי וממיסים את המשקע עם 0.3 מ"ל מים. להשיג את תמיסות הסופרנאטנט והזירוז (הן ננו-תחליב ריק והן חיסון) לאחר הטיפול באתנול מוחלט ותמיסת מים מזוקקים, ולבצע את אותו דילול פי 50.
- מערבבים 2.5 מ"ל של ג'ל הפרדה A ו 2.5 מ"ל של ג'ל הפרדה B (ראה טבלת חומרים), מוסיפים 50 μL של 10% אמוניום פרסולפט, ומניחים במהירות את התמיסה בצלחת הזכוכית עם פיפטה. מערבבים 1 מ"ל של ג'ל מרוכז A ו-1 מ"ל של ג'ל B מרוכז, מוסיפים 20 מיקרוליטר של 10% אמוניום פרסולפט לצלחת הזכוכית, מכניסים מסרק בגודל מתאים ומחכים להתמצקות.
- הוסף סך של 5 μL של תמיסת חיץ העמסת חלבון 5x לדגימה המדוללת שהתקבלה בשלב 3.5.2, והרתיח את הדגימה במשך 5 דקות.
- מוסיפים 10 μL חלבון מחומם לבאר המתאימה, ומוסיפים 5 μL של סמן חלבון לסמן היטב.
- חבר את האלקטרודה, הפעל את מד האלקטרופורזה (ראה טבלת חומרים) וכוונן את המתח ל- 300 V. כבה את החשמל כאשר האלקטרופורזה מגיעה למרחק של 1 ס"מ מתחתית גומי PAGE.
- מוציאים את הג'ל ושוטפים במים מזוקקים פעמיים (ddH2O). הוסיפו את תמיסת הצביעה G-250 בצבע כחול בהיר של קומאסי (ראו טבלת חומרים) למשך 10 דקות. יוצקים את תמיסת הצביעה, שוטפים את הג'ל פעמיים בתמיסה ובתמיסת הסרת הצבע המסחרית ומחממים את הג'ל במיקרוגל למשך דקה. נערו את הג'ל במשך 10 דקות, ושנו שוב ושוב את תמיסת הסרת הצבע עד שרקע הג'ל ברור. לאחר מכן, בצע הדמיית ג'ל (ראה טבלת חומרים).
הערה: הכתם המערבי עובד מראש, כמתואר בשלבים 3.5.1-3.5.6.
- השרו שלושה גושי נייר מסנן עם מאגר העברת אלקטרופורזה. משרים את קרום הפוליווינילידן פלואוריד (PVDF) במתנול למשך 30 שניות ומעבירים באמצעות מכשיר העברת ג'ל חצי יבש (שתי שכבות של נייר סינון, קרום PVDF, ג'ל אלקטרופורזה ושכבה אחת של נייר סינון). השתמש במתח של 23 V כדי להעביר את הממברנה למשך 23 דקות.
- יש להסיר את קרום ה-PVDF ולשטוף פעם אחת במי מלח-טווין 20 (TBST) לאחר ההעברה.
- יש להניח את קרום PVDF בתמיסת איטום (תמיסת אבקת חלב דל שומן 5%) ולאטום למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
- הסירו את קרום ה-PVDF ושטפו שלוש פעמים עם TBST או 10 דקות כל אחת.
- לדגור עם הנוגדן הראשוני (מעכברים מחוסנים עם סרום חיובי). לדלל את הנוגדן הראשוני (ראה טבלת חומרים) כדי להיבדק פי 500 (פי 100) עם TBST. הניחו את קרום PVDF החסום בנוגדן הראשוני ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
- הסירו את קרום ה-PVDF ושטפו שלוש פעמים עם TBST במשך 10 דקות כל אחת.
- לדגור עם הנוגדן המשני (ראה טבלת חומרים). לדלל פוספטאז אלקליין (AP) - תווית עז נוגדן משני נגד עכבר פי 5,000 עם TBST. מניחים את קרום PVDF בנוגדן המשני ודגורים בטמפרטורה של 37°C למשך 40 דקות.
- הסר את קרום PVDF ושטוף ארבע פעמים עם TBST במשך 10 דקות כל אחת.
- יש לטבול את קרומי PVDF בתערובת (בדיוק מספיק כדי להשרות את הממברנה) של מצע AP ניטרו כחול טטרזול (NBT) ו-BCIP (5-ברומו-4-כלורו-3'-אינדוליפפוספט p-toluidine salt) (ראו טבלת חומרים) לצורך צביעה. תוצאה חיובית היא purple.
הערה: התוצאות חייבות להיות פס סגול ברור, ורצועת הדגימה והמשקל המולקולרי של האנטיגן צריכים להיות באותו מיקום מסומן.
4. הערכת התגובה החיסונית של נוגדנים לחיסון זה לאחר מתן תוך שרירי
הערה: העכברים חוסנו בהזרקה תוך שרירית של חיסון ננו-תחליב בעקבות דו"ח שפורסם. העכברים קיבלו PBS כביקורת שלילית. שבוע לאחר השלמת שלושה חיסונים, נאסף הסרום מהעכברים. רמות IgG בסרום ותת-הקבוצות של IgG1, IgG2a ו-IgG2b נקבעו כמותית על ידי בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA).
- ציפוי אנטיגן: לדלל אנטיגן חלבון HI ל 10 מיקרוגרם / מ"ל עם תמיסת ציפוי ולהוסיף לצלחת ELISA ב 100 μL / באר. יש לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
הערה: פתרון הציפוי מוכן על ידי המסת 1.6 גרם של נתרן פחמתי נטול מים ו 2.9 גרם של סודיום ביקרבונט ב 1 L של מים deionized.
- איטום: שטפו את הצלחת (שלושה מחזורים, כל מחזור 300 מיקרוליטר). הוסף 300 μL של תמיסת האיטום לכל באר, ואטם את הבארות למשך שעתיים ב 37 ° C.
הערה: פתרון האיטום מוכן על ידי הוספת Tween-20 ואלבומין בסרום בקר (BSA) ל- PBS. התוכן של BSA בפתרון PBST הוא 1%.
- דילול סרום: דללו את סרום הדגימה של עכברים 100 פעמים עם PBST (קחו 3 מיקרוליטר של סרום והוסיפו אותו ל-297 מיקרוליטר של PBST ומערבולת), והשתמשו ב-100 מיקרוליטר לכל דגימת סרום. לדלל את הסרום החיובי ואת סרום הבקרה השלילית 100 פעמים עם PBST על ידי הוספת 4 μL ל 396 μL של PBST, ולאחר מכן ערבוב על ידי מערבולת.
- דילול יחס כפול: הוסף 200 μL של הסרום הניסיוני המדולל לעיל לשורה הראשונה של צלחת ELISA המצופה והוסף 100 μL של PBST לכל הבארות למעט השורה הראשונה וה-12. בצע דילול של 1:2 ברציפות מהשורה הראשונה: כוונן את הפיפטה ל -100 μL, העבר 100 μL מהשורה הראשונה לשורה השנייה, וערבב עם פיפטה 10 פעמים.
- לדלל את הסרום לשורה 11 ביחסים מרובים ולהשליך 100 μL של נוזל.
- הוסף סרום שלילי וחיובי מדולל לבארות המתאימות בשורה 12 בהתאם לתבנית לדוגמה (ראה טבלה 1)-100 μL/well.
- אטמו את צלחות ELISA בניילון נצמד ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת.
- לדלל נוגדנים משניים נגד עכבר IgG-HRP (ראה טבלת חומרים) עם PBST בקנ"מ 1:10,000.
- לשטוף את הצלחת (שלושה מחזורים, כל מחזור 300 μL). לאחר מכן, להוסיף 100 μL של נוגדן משני מדולל לכל באר, לדגור את הצלחת ב 37 ° C במשך 40 דקות.
- צביעה וסיום: שטפו את הצלחת (חמישה מחזורים, כל מחזור 300 מיקרוליטר). הוסף תמיסת צביעה 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) (100 μL; ראה טבלת חומרים) לכל באר. הניחו את הלוחות בטמפרטורה של 37°C למשך 10 דקות הרחק מהאור, ולאחר מכן סיימו את התגובה מיד עם 50 μL של 2 M H2SO4.
- זהה את ערך הצפיפות האופטית (OD450) על-ידי סמן אנזים (קרא את הערך OD450 תוך 15 דקות לאחר הסיום).
טבלה 1: תבנית רצף קוצים ודילול של ELISA.
