1. הערכת המחשוף או הפירוק של חלבונים בנגיף שפעת A, תאים נגועים ב- IAV על ידי קספזות
- זרע 3 x 105 Madin-Darby כליה כלבית (MDCK) או A549 תאים לכל באר בצלחת תרבית תאים של 12 בארות.
הערה: אם אתם משתמשים בתאי MDCK, ודאו שהנוגדן נגד החלבון המעניין מזהה את מין הכלבים שלו.
- זרעו את הבארות בזוגות, כלומר, זוג ביקורת - באר אחת לדגימה המדומה הלא נגועה ואחת לדגימה המדומה הנגועה, זוג בדיקה - אחת לדגימה מעכב לא נגוע A ואחת לדגימה מעכבת A הנגועה. הגדל את מספר הזוגות עם כל מעכב נוסף.
- לדגור על התאים ב 37 ° C תחת 5% CO2 אטמוספירה לילה.
- למחרת, להדביק את התאים עם IAV (תת-סוג H1N1 או תת-סוג אחר).
- לשם כך, הכינו את החיסון נגד הנגיף על ידי דילול מלאי הנגיף ב-400 מיקרוליטר של מדיום חיוני מינימלי (MEM) ללא סרום (ראו טבלת חומרים) בריבוי זיהומים (MOI) של 0.5-3.0 יחידות יוצרות פלאק (pfu)/תא (גורם להכפלת מספר התא בעת חישוב MOI).
הערה: להדבקת תאי MDCK, יש להשלים את החיסון נגד הנגיף עם טוסיל פנילאלניל כלורומתיל קטון (TPCK)-טריפסין בריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל.
- הסר את מדיום התרבית הישן מהתאים (שלב 1.3) ושטוף את התאים עם 1 מ"ל / באר של MEM 2x ללא סרום.
- הוסף 400 μL של חיסון וירוס (שלב 1.4.1) לתאים ודגור אותם במשך שעה אחת ב 35 ° C תחת 5% פחמן דו חמצני (CO2) אטמוספירה.
- בינתיים, דללו מעכב קספז (למשל, Z-DEVD-FMK), מעכב ליזוזום (למשל, אמוניום כלורי, NH4Cl), או מעכב פרוטאזום (למשל, MG132) (ראו טבלת חומרים) בריכוז סופי של 40 מיקרומטר, 20 מילימטר או 10 מיקרומטר, בהתאמה, ב-MEM נטול סרום (ראו טבלת חומרים). שני המעכבים האחרונים משמשים כבקרה. יש לדלל נפח שווה של הממס (אם אינו מים) המשמש לשחזור אחד המעכבים בתווך נטול סרום כמדומה.
- הסר את החיסון וירוס ולשטוף את התאים כמו בשלב 1.5 (1x).
- הוסף את MEM ללא סרום, 1 מ"ל / טוב, מדומה או בתוספת מעכב, לתאים ודגור על התאים כמו בשלב 1.6. נקודת זמן זו נחשבת זיהום 0 שעות.
- לאחר 24 שעות, לקצור את התאים על ידי גירוד אותם עם מזרק 1 מ"ל בוכנה (צד גומי) ולהעביר אותם לתוך צינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה את הצינור ב 12,000 x גרם במשך 1-2 דקות בטמפרטורת החדר. אוספים את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה.
הערה: ניתן היה להשליך את הסופרנאטנט הזה או להשתמש בו לבדיקת פלאק כדי למדוד את הטיטר של צאצאי הנגיף ששוחררו.
- שטפו את גלולת התא עם 250 מיקרוליטר של מלח חוצץ פוספט (PBS) על ידי צנטריפוגה מחדש כמו בשלב 1.11.
- הסר את supernatant ו lyse את התאים על ידי הוספת 80-100 μL של חיץ ליזה התא (50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (THAM) hydrochloride (Tris-HCl), pH 7.4, 150 mM נתרן כלורי (NaCl), 0.5% נתרן דודציל סולפט (SDS), 0.5% deoxycholate נתרן, 1% Triton X-100, ו 1x קוקטייל מעכב פרוטאז, ראה טבלה של חומרים) ומערבולות.
- מחממים את הצינור ב 98 ° C במשך 10 דקות כדי lyse לחלוטין ולהכין את התא הכולל lysate. אחסנו את הליזטים בטמפרטורה של 4°C לביצוע שלבים 1.15-1.17 למחרת, אך לקבלת התוצאות הטובות ביותר, סיימו שלבים אלה באותו היום.
- הערך את כמות החלבון בכל דגימה באמצעות ערכת בדיקת טבלה של חומצה ביכומונית (BCA) (ראה טבלת חומרים).
- פתור כמויות שוות של חלבון מדגימות לא נגועות ונגועות באמצעות אלקטרופורזה סטנדרטית של ג'ל SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) יחד עם סמני משקל מולקולריים.
- העבירו את החלבון לקרום ניטרוצלולוז או פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) (ראו טבלת חומרים).
הערה: קרום PVDF עשוי לתת רקע גבוה בחלק ממצלמות הכתמים המערביות; בדוק תאימות.
- בצע הכתמה מערבית כדי לזהות את החלבון המעניין באמצעות השיטה המתוארת במקום אחר.
- השוו את רמות החלבון בנתיבי הדגימה הנגועים שטופלו במוק ובמעכבים.
הערה: אם רמת החלבון התאוששה בנתיב הדגימה הנגועה שטופלה במעכבי קספז, אז החלבון נבקע או מתפרק על ידי קספזה. אחרת, הוא מושפל על ידי ליזוזום או פרוטאזום.
- כמת את התאוששות החלבון על ידי מדידת עוצמת הפס שלו בכל נתיב מלפחות שלושה עותקים משוכפלים של אותו ניסוי ונרמול אותו עם פס בקרת ההעמסה המתאים.
- השתמש בכל מכשיר הדמיה עכשווי ובתוכנה הנלווית אליו (ראה טבלת חומרים) כדי לדמות את הכתמים המערביים ולכמת את שחזור החלבון.
