בדיקה למדידת הצטברות של בדיקה אנטיביוטית פלואורסצנטית בתאי חיידקים

תקציר

מקור: Stone, M. R. L., et al. Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת הצטברות של בדיקה אנטיביוטית פלואורסצנטית בתאי חיידקים. חשיפה למעכב משאבת אפלוקס משבשת את שיפוע הפרוטון הטרנסממברנה בתאי חיידקים, שעליו מתווספת אנטיביוטיקה מצומדת פלואורופור. עיכוב של משאבות אפלוקס עקב שיפוע פרוטונים משובש גורם להצטברות של אנטיביוטיקה בתוך החיידקים. תאי חיידקים עוברים ליזה, ועוצמת הפלואורסצנטיות נמדדת כדי לאשר הצטברות אנטיביוטיקה.

פרוטוקול

1. הערכת פעילות מיקרוביאלית

הערה: כל עבודה המערבת חיידקים צריכה להתבצע בתנאים סטריליים כדי למנוע זיהום של הבדיקה או המעבדה. כל המדיה צריכה להיות autoclaved לפני השימוש, כלי פלסטיק וציוד כגון פיפטות חייב להיות סטרילי. מומלץ לבצע את העבודה במכסה מנוע ביולוגי (סוג 2).

1. פזרו מלאי גליצרול של זני חיידקים המתאימים לפיגום האנטיביוטי על אגר מרק ליזוגני (LB, הוכן לפי הוראות היצרן), וגדלו במשך הלילה בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: בחירת החיידקים לבדיקת פעילות אנטיבקטריאלית חייבת להיעשות על בסיס הפיגום האנטיביוטי בו משתמשים. יש לבחור טווח מייצג של 5-10 חיידקים מתוך הזנים הידועים כרגישים לאנטיביוטיקה, תוך התחשבות ביכולות הלוגיסטיות של המעבדה. במידת האפשר, יש לבדוק גם חיידקים עמידים. הפרוטוקול המפורט להלן יעבוד על רוב החיידקים, אך בדוק אם נדרשים תנאים מיוחדים (למשל, CO₂, מדיה מיוחדת) ובצע שינויים לפי הצורך. חיידקים שנבדקו בהצלחה באמצעות תנאים אלה כוללים Staphylococci, Streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, ו Enterococcus faecium.
2. בחרו מושבה בודדת מהצלחת, ותרבו לילה ב-5 מ"ל של מרק מולר-הינטון מותאם קטיון (CAMHB, מוכן לפי הוראות היצרן) ב-37°C.
3. לדלל את תרביות הלילה ~ פי 40 ב- CAMHB ולגדול לשלב אמצע לוג, צפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD₆₀₀) = 0.4-0.8, נפח 5 מ"ל).
4. הכינו תמיסות מלאי של כל אנטיביוטיקה פלואורסצנטית במינון 1.28 מ"ג/מ"ל במים סטריליים, ופיפטה 10 מיקרוליטר אנטיביוטיקה לעמודה הראשונה של צלחת באר 96.
5. הוסף 90 μL של CAMHB לעמודה הראשונה ו- 50 μL לכל הבארות האחרות. לאחר מכן, בצע דילול סדרתי פי 2 על פני הצלחת.
6. ערבבו היטב, ואז דללו את תרביות שלב היומן האמצעי ל~10⁶ יחידות יוצרות מושבה (CFU) / מ"ל והוסיפו 50 μL לכל הבארות, כדי לספק ריכוז סופי של ~ 5 x 10⁵ CFU/mL.
   נפח התרבות (mL) = (נפח מדיה ב- mL)/(OD₆₀₀ x 1,000)
   לדוגמה, עבור תרבות OD₆₀₀ = 0.5 בנפח מדיה רצוי של 12 מ"ל, הוסף (12/(0.5 x 1,000) = 0.024 מ"ל של תרבית ל- 12 מ"ל של מדיה
7. מכסים את הצלחות במכסים ודגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות ללא רעידות.
8. בדוק חזותית את הלוחות, כאשר המיקרופון הוא הריכוז הנמוך ביותר ללא צמיחה נראית לעין.
   הערה: ראו טבלה 1 לכמה דוגמאות של אנטיביוטיקה פלואורסצנטית פעילה ולא פעילה.

2. ניתוח הצטברות גשושית על ידי ספקטרופוטומטריה

הערה: זמני צנטריפוגות אלה הותאמו עבור E. coli, כך שייתכן שיהיה צורך בשינויים קלים עבור מינים אחרים. נתונים מייצגים עבור הצטברות בדיקה מדווחים עבור בדיקת ciprofloxacin המסומנת NBD.

1. פזרו מלאי גליצרול של זני החיידקים על אגר LB וגדלו בן לילה בטמפרטורה של 37°C.
2. בחר מושבה אחת מהצלחת והתרבות לילה ב LB ב 37 ° C.
3. לדלל תרביות לילה ~ פי 50 במדיה ולגדול לשלב אמצע יומן (OD₆₀₀ = 0.4-0.8).
4. צנטריפוגה את התרביות ב 1,470 x גרם במשך 25 דקות ו decant התקשורת.
5. השהה מחדש את החיידקים ב-1 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), ולאחר מכן צנטריפוגה ב-1,470 x גרם למשך 15 דקות.
6. דקר את המדיה והשהה מחדש את הכדורים השטופים ב- PBS ל- OD₆₀₀ סופי = 2.
7. אם תרצה, הוסף 10.1 μL של קרבוניל ציאניד 3-chlorophenylhydrazone (CCCP, 10 mM ב- PBS) ל- 1 מ"ל חיידקים (ריכוז סופי 100 μM) ודגור ב- 37 ° C למשך 10 דקות.
   הערה: CCCP הוא מעכב משאבת אפלוקס. הוספת CCCP תאפשר לבחון את השפעת האפלוקס.
8. צנטריפוגה את התרביות ב 18,000 x גרם במשך 4 דקות ב 20 ° C ו decant את התקשורת.
9. הוסף 1 מ"ל של תמיסת אנטיביוטיקה פלואורסצנטית (10-100 מיקרומטר ב- PBS) לכדורית, ודגר ב- 37 ° C למשך 30 דקות.
10. צנטריפוגה את התרביות ב 18,000 x גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C ו decant את התקשורת.
11. להשעות מחדש את החיידקים ב 1 מ"ל של PBS קר, ולחזור על שלב 2.9.
12. חזור על שלב 2.10 בסך הכל 4x.
13. אם תרצה, חיידקי ליז על ידי הוספת 180 μL של חיץ ליזה (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, ו 2 mM נתרן EDTA) ולאחר מכן 70 μL של lysozyme (72 מ"ג / מ"ל ב H₂O).
14. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות, ולאחר מכן להקפיא-להפשיר 3x (-78°C למשך 5 דקות, ואז 34°C למשך 15 דקות).
15. סוניק את הדגימות במשך 20 דקות, ולאחר מכן לחמם ל 65 ° C במשך 30 דקות.
16. צנטריפוגו את דגימות הליזה (18,000 x גרם, 8 דקות), ולאחר מכן סננו דרך קרום מסנן של 10 kDa .
17. לשטוף את המסנן 4x עם 100 μL של מים.
18. מעבירים את הליזט לצלחת באר 96 שחורה בעלת תחתית שטוחה ומודדים את עוצמת הפלואורסצנטיות על קורא לוחות עם אורכי גל עירור ופליטה המתאימים לפלואורופור (כלומר, 7-(דימתילאמינו)-2-אוקסו-2H-כרומן-4-yl [DMACA]: λ_ex = 400 ננומטר, λ_em = 490 ננומטר; nitrobenzoxadiazole [NBD]: λ_ex = 475 ננומטר, λ_em = 545 ננומטר).
    הערה: ראו איור 1 לדוגמאות של ניתוחים ספקטרופוטומטריים של חיידקים באמצעות אנטיביוטיקה ציפרופלוקסצין פלואורסצנטית עם תווית NBD.

תוצאות

טבלה 1. פעילות אנטיביוטית של בדיקות אנטיביוטיות פלואורסצנטיות המבוססות על ציפרופלוקסצין, טרימטופריים ולינזוליד כנגד זני חיידקים מתאימים רלוונטיים מבחינה קלינית, כפי שנמדדו על ידי בדיקות מיקרודילולציה של מיקרו-דילול מרק. ברוב המקרים, הגשושיות איבדו פעילות מסוימת בהשוואה לתרופת האם, אך שמרו על עוצמה אנטיביוטית מדידה מסוימת (מספיק כדי להיות שימושית במחקרים נוספים).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
יחידת המסנן הצנטריפוגלי Amicon Ultra-0.5 עם Ultracel- 10 ממברנה	מרק	UFC501096
ספקטרומטר Bruker Avance 600 MHz	ברוקר
CCCP	סיגמא-אולדריץ'	C2759
סליט 545	סיגמא-אולדריץ'	22140-5KG-F
סיגל	ABCAM	AB109204
FM4-64FX, אנלוגי ניתן לתיקון של כתם קרום FM™ 4-64	Life Technologies אוסטרליה Pt	F34653
גמא 2-16 LSCplus ליופיליז	ישו
Hettich Zentrifugen Rotofix 32	הטיך
ליברות	אמרסקו	J106
ליזוזים מחלבון ביצת תרנגולת אבקה ליופילית	סיגמא-אולדריץ'	L6876
Mueller Hinton II מרק קטיון מותאם	בקטון דיקינסון	212322
סיגמא 1-15 מיקרוצנטריפוגה	סיגמא-אולדריץ'
TECAN Infinite M1000 PRO	טקאן