כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. השגת תאי T רוצחים טבעיים אינווריאנטיים (תאי iNKT) עם טיפול תאי מאמץ
- אינדוקציה כיוונית של תאי iNKT
- הזריקו לעכברים רגילים תוך צפקית α-Galactosylceramide (α-GalCer) (0.1 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
- בידוד תאי iNKT
- שלושה ימים לאחר הדוגמנות, יש להזריק לעכברים 1% נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג משקל גוף) לצורך הרדמה. עכברים מורדמים כראוי אינם מראים תגובת נסיגה של כפה אחורית לצביטת בוהן.
- בודד את הטחול של עכבר DBA/1 לאחר הזרקתו תוך צפקית עם α-GalCer. הכינו תרחיף חד תאי על ידי חיתוך וטחינת הטחול במסננת של 200 רשתות.
- שטפו את מתלה התא במי מלח חוצצי פוספט (PBS), בצנטריפוגה במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות, והשליכו את הסופרנטנט. חוזר.
- להשעות את התאים עם 1 מ"ל של דם שלם פתרון דילול רקמות. הוסף 3 מ"ל של מדיום הפרדת לימפוציטים עכבר, ולאחר מכן צנטריפוגה את התאים במשך 20 דקות ב 300 x גרם בטמפרטורת החדר.
- אספו את שכבת הלימפוציטים הלבנים החלביים (כלומר, השכבה השנייה מלמעלה), שטפו אותה 2x עם PBS, וספרו עם מונה תאים אוטומטי.
- אסטרטגיית בחירה חיובית של מיון תאים מופעלים מגנטיים (MACS) לטיהור תאי iNKT
הערה: עבור טיפול מקדים של טטרמרים CD1d, 1 מ"ג / מ"ל של α-Galcer היה מדולל ל 200 מיקרוגרם / מ"ל עם 0.5% של Tween-20 ו 0.9% של NaCl, ו 5 μL של התמיסה שהתקבלה נוספה 100 μL של תמיסת טטרמר CD1d. התערובת הודגרה במשך 12 שעות בטמפרטורת החדר והונחה על 4 מעלות צלזיוס לשימוש. קולטן תאי T (TCR) β דולל פי 80 במים שעברו דה-יוניזציה. כל שאר הנוגדנים שימשו כתמיסת מלאי.
- להשהות 107 תאים עם 100 μL של 4 ° C PBS, להוסיף 10 μL של CD1d טעון α-GalCer Tetramer-phycoerythrin (CD1d Tetramer-PE), ולדגור אותם ב 4 ° C במשך 15 דקות בחושך.
- לשטוף את התאים 2x עם PBS ולהשעות אותם מחדש 80 μL של PBS.
- הוסף 20 μL של anti-PE-MicroBeads ודגור אותם ב 4 ° C במשך 20 דקות בחושך.
- שטפו אותם 2x עם PBS והשעו מחדש את התאים עם 500 μL של PBS.
- מקם את עמודת המיון בשדה המגנטי של ממיין MACS ושטוף עם 500 μL של PBS.
- הוסף את מתלה התא משלב 1.3.4 לעמודת המיון, אסוף את הזרימה ושטוף 3x עם מאגר PBS.
- הסר את השדה המגנטי ואסוף את התאים מעמודת המיון. בשלב זה, הוסף 1 מ"ל של מאגר PBS לעמודת המיון ודחוף במהירות את הבוכנה בלחץ קבוע כדי להניע את התאים המסומנים לצינור האיסוף ולקבל תאי iNKT מטוהרים. ספירה באמצעות מונה תאים אוטומטי.