מאמר שיטה

שיפור התמרה נגיפית בתאי הרג טבעיים באמצעות פולימר קטיוני

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Nanbakhsh, A., et al. Dextran משפר את יעילות ההתמרה הלנטיווירלית של תאי NK ראשוניים של מורין ואדם. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים בדיקה להתמרה נגיפית בתיווך פולימר קטיוני בתאי הרג טבעי (NK). התאים מודגרים עם וקטורים לנטי-וירוסים טרנסגניים המקודדים חלבון פלואורסצנטי. הוספת פולימר קטיוני מאפשרת לנגיף להיצמד לתאים ולשלב את הרנ"א שלו בגנום המאכסן, המבטא את החלבון הפלואורסצנטי. הפלואורסצנטיות מכומתת כדי להעריך את השיפור המושרה על ידי פולימר של טרנסדוקציה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. התמרה של תאי NK ראשוניים מורין ואנושיים עם lentivirus

  1. השהה עכבר או תאי NK ראשוניים אנושיים בצלחת של 24 בארות ב- 0.5 × 105/מ"ל של מדיום בנוכחות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לנטיוירוס סופרנאטנט ב 5, 10 ו -20 ריבוי זיהום (MOI) ובנוכחות Pb (8 מיקרוגרם / מ"ל), PS (8 מיקרוגרם / מ"ל) או דקסטרן (8 מיקרוגרם / מ"ל).
  2. צנטריפוגה את הצלחות ב 1,000 × גרם במשך 60 דקות.
  3. מבלי לנטרל את הסופר-נטנט, תרבית את התאים למשך הלילה (16-18 שעות) באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס המוחדר ב-5.2% CO2.
  4. לשטוף עם 10 מ"ל של PBS ולהשהות מחדש ב 2 מ"ל של שלמות Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 מדיום תרבות בנוכחות interleukin 2 (IL-2, 300 U / mL).
  5. קצרו את תאי ה-NK המומרים ביום השביעי על ידי הקשה עדינה על הצלוחיות.
    1. הפעל את התאים שנקטפו עם ריכוזי טיטראט של קבוצת רוצחים אנטי-טבעיים הקשורים לצלחות 2D (NKG2D) (A10) mAb על ידי ציפוי לוחות פוליסטירן 96 באר וסופגים מאוד חלבון בריכוזים של 2.5 מיקרוגרם/מ"ל של anti-NKG2D mAb למשך הלילה.
    2. שטפו כל באר עם 100 μL של מלוחים חוצצי פוספט (PBS) שלוש פעמים לפני הוספת תאי NK ראשוניים.
  6. אספו סופרנאטנטים בתרבית באמצעות פיפטה רב-ערוצית בין 16 ל-18 שעות לאחר ההפעלה כדי לכמת ציטוקינים כגון אינטרפרון-גמא (IFN-γ). צור עקומות סטנדרטיות באמצעות הציטוקינים הרקומביננטיים המסופקים עם ערכות בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים (ELISA).
  7. בדוק את הכדאיות של תאי NK באמצעות צביעת annexin-V/7-amino-actinomycin D (7-AAD) וקבע את אחוז התאים הנמקיים בין תאי NK שעברו טרנספורמציה באמצעות ציטומטר זרימה.
    1. כדי לבצע בדיקה זו, קצרו את תאי המורין ותאי ה-NK האנושיים ארבעה ימים לאחר הטרנסדוקציה, שטפו פעמיים עם 10 מ"ל PBS קר ב-500 × גרם למשך 5 דקות כל אחד, ודגרו עם ערכת Annexin-V (PE)/7-AAD.
  8. השתמש בתוכנת ציטומטריית זרימה מתאימה כדי לנתח את הנתונים. בחר את אוכלוסיית התאים החיים ונתח את הביטוי של GFP (ערוץ פלואורסצאין איזותיוציאנט [FITC]) כמדד להתמרה ויראלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דקסטרןסיגמא-אולדריץ'90-64-91-9
פוליברן (Pb)סיגמא-אולדריץ'TR-1003
פרוטאמין סולפט (PS)סיגמא-אולדריץ'עמ' 3369
RPMI1640קורנינג10-040-CV
אינטרפרון גמא (IFN-γ )eBioscience14-7311-85
פתרון צביעת Propidium lodideב.ד.51-66211E
ליפופקטמין 3000תרמו פישרL3000015
איזופלורןפניקסנד"ג 57319-559-05
293T תאיםATCCCRL-3216
T75 צלוחיותקורנינג430641U
ערכות ELISAEbioscience00-4201-56

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

2

מאמרים קשורים