מאמר שיטה

הדבקת מקרופאגים ראשוניים עם mRNA שונה

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Herb, M. et al., Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Trancribed mRNA. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את התהליך של הדבקת מקרופאגים ראשוניים עם mRNA שונה המקודד חלבון פלואורסצנטי ירוק. אלה mRNA שונה, שנועדו להפחית אימונוגניות ולשפר את יציבותה, להבטיח transfection מוצלח ביטוי הבא של חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים, אשר אושר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

הערה: בצע את כל השלבים עם כפפות. בצע את כל שלבי הטרנספקציה מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית כדי למנוע זיהום של התאים. לפני העבודה עם mRNA, נקו את כל המכשירים כגון פיפטות וכל משטח עם 70% אתנול ו/או חומר פעילי שטח מפרק RNAse (טבלה של חומרים). ודא שכל צינורות התגובה הם נטולי RNAse וסטריליים. יש להשתמש רק במים סטריליים נטולי RNAase לדילול. השתמשו באופן בלעדי בקצוות פיפטה עם פילטרים. החליפו קצוות פיפטה לאחר כל שלב פיפטה.

1. יצירת תבנית הדנ"א

הערה: תבנית ה- DNA עבור שעתוק mRNA במבחנה באמצעות פרוטוקול זה חייבת להכיל רצף פרומוטורי T7 כדי לאפשר עגינה של RNA פולימראז. אם הפלסמיד המכיל את רצף הדנ"א של החלבון המעניין כבר מכיל רצף פרומוטורי T7 מכוון נכון ישירות במעלה הזרם של רצף העניין, יש לבצע ליניאריזציה של הפלסמיד (ראה שלב 1.1). אחרת, חבר פרומוטור T7 לרצף העניין על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR, ראה שלב 1.2).

  1. ליניאריזציה של פלסמידים המכילים פרומוטור T7
    1. פלסמידים ליניאריים שכבר מכילים רצף פרומוטורי T7 בכיוון הנכון על ידי עיכול עם אנזים הגבלה חותך במורד הזרם של קודון העצירה של רצף העניין. אחרת, התמלול לא יסתיים כראוי לאחר רצף העניין.
      הערה: עדיף להשתמש באנזימי הגבלה המשאירים קצוות קהים או 5 'overhangs.
    2. לאשר ליניאריזציה מלאה של פלסמיד על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose של DNA פלסמיד מעוכל לעומת מעוכל.
    3. טיהור DNA פלסמיד ליניארי לפני השימוש בו כתבנית DNA לשעתוק mRNA במבחנה באמצעות ערכת טיהור DNA (רשימת חומרים).
  2. חיבור של מנוע T7 על ידי PCR
    1. השתמש בפריימר קדמי המכיל את הרכיבים הבאים (בסדר המצוין מ- 5' עד '3): בערך 5 bp אקראי במעלה הזרם של המנוע (למשל, GAAAT); רצף פרומוטור T7 (TAATACGACTCACTATAG); שני Gs נוספים ליעילות שעתוק מוגברת (GG); החלק הספציפי לרצף המטרה שהוא הומולוגי לרצף הפלסמיד המקיף את קודון ההתחלה.
      הערה: זה צריך להיות מורכב מ 3-6 bp במעלה הזרם של רצף KOZAK ולהתחיל קודון, רצף KOZAK ולהתחיל קודון (בדרך כלל GCCACC ATG G), 12-18 bp במורד הזרם של קודון התחלה. אם רצף העניין אינו מכיל כבר רצף KOZAK או קודון התחלה, ניתן לצרף אותם בשלב זה פשוט על ידי הכללתם ברצף הפריימר.
    2. חשב את tm של פריימר קדימה רק על ידי לקיחה בחשבון את החלק הומולוגי לרצף היעד.
    3. כדי להעריך את היווצרות הדימרים / סיכות השיער השתמשו בכל רצף הפריימר, שיכול בקלות לעלות על 50 bp.
    4. השתמש פריימר הפוך הממוקם איפשהו במורד הזרם של codon.
      הערה: אם רצף העניין אינו מכיל כבר קודון עצירה, ניתן לצרף אותו בשלב זה פשוט על ידי הכללתו ברצף הפריימר.
    5. השתמש בפריימרים קדימה ואחורה כדי לבצע PCR באמצעות פולימראז באיכות גבוהה עם הגהה (טבלה של חומרים).
    6. אשר יצירה של מוצר יחיד וגודל אמפליקון על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (למשל, השתמש בג'ל אגרוז 1% וזרם קבוע של 100 וולט).
    7. לטהר את מוצר ה-PCR לפני השימוש כתבנית חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA) עבור שעתוק חומצה ריבונוקלאית שליח במבחנה (mRNA) באמצעות ערכת טיהור DNA.

2. דור mRNA

  1. הפשירו את כל רכיבי ערכת השעתוק mRNA במבחנה (ראו טבלת חומרים). מערבולת במשך 5 שניות וסחרור כלפי מטה במשך 2 שניות במהירות של 2,000 x גרם. יש לשמור על קרח עד לשימוש.
  2. הכן את תמהיל התגובה לשעתוק mRNA במבחנה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל בסדר הבא (נפח כולל של 40 μL): 20 μL של תערובת 10x אנלוגים נגד כובע הפוך / נוקלאוזיד טריפוספט (ARCA/NTP) תערובת (כלולה בערכת השעתוק mRNA במבחנה); 0.25 μL של 5-methyl-cytidine triphosphate (5-mCTP) (ריכוז סופי (f.c.) הוא 1.25 mM; 50% מכלל CTP); 0.25 מיקרוליטר של פסאודו-אורידין טריפוספט (פסאודו-UTP) (f.c. הוא 1.25 מ"מ; 50% מכלל UTP); X μL של תבנית DNA; 2 μL של תערובת T7 RNA פולימראז (כלול בערכת שעתוק mRNA במבחנה); Y μL של H נטול RNAse2O.
    הערה: X הוא נפח המכיל לפחות 1 מיקרוגרם של DNA. לדוגמה, 1.6 μL מתמיסת מלאי של 625 ng/μL. Y הוא הנפח הרזרבי לנפח הכולל של 40 μL.
  3. מערבולת במשך 5 שניות וסחרור כלפי מטה במשך 2 שניות במהירות של 2,000 x גרם. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות ב-400 סל"ד על מערבל תרמי לשעתוק חוץ גופי.
  4. לאחר מכן, הוסף 2 μL של DNase I ישירות לתוך תערובת התגובה להסרת DNA התבנית. מערבולת במשך 5 שניות וסחרור כלפי מטה במשך 2 שניות במהירות של 2,000 x גרם.
  5. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות ב-400 סל"ד על מערבל תרמי. קח aliquot של 2 μL עבור ג'ל הבקרה (שלב 3.3) ולאחסן ב -80 ° C.
  6. עבור זנב פולי(A), הוסף את הרכיבים הבאים ישירות לתמהיל התגובה הקודם (לנפח סופי של 50 μL): 5 μL של 10x פולימראז פולימראז חיץ תגובה ו 5 μL של פולי(A) פולימראז (שניהם כלולים בערכת שעתוק mRNA במבחנה). מערבולת במשך 5 שניות וסחרור כלפי מטה במשך 2 שניות במהירות של 2,000 x גרם.
  7. דוגרים על התערובת ב-37°C למשך 30 דקות ב-400 סל"ד על תרמומיקסר. קח aliquot של 2 μL עבור ג'ל הבקרה (שלב 3.3) ולאחסן ב -80 ° C.
  8. עבור דה-פוספורילציה של 5 קצוות ה-mRNA, הוסף את המרכיבים הבאים ישירות לתערובת התגובה הקודמת (לנפח סופי של 60 μL): 3 μL של H2O נטול RNAse; 6 μL של 10x חיץ תגובת פוספטאז אנטארקטי; 3 μL של פוספטאז אנטארקטי (15 יחידות עבור נפח תגובה של 60 μL). מערבולת במשך 5 שניות וסחרור כלפי מטה במשך 2 שניות במהירות של 2,000 x גרם.
  9. דוגרים על התערובת בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות ב-400 סל"ד במערבל תרמי.
  10. פוספטאז אנטארקטי מושבת חום על ידי דגירה ב 80 ° C למשך 2 דקות.
    הערה: באופן אידיאלי, להשתמש מערבל תרמי נפרד, לא לחכות עד מיקסר הראשון מגיע לטמפרטורה הרצויה.

3. טיהור mRNA

  1. לטהר את ה-mRNA המשועתק במבחנה באמצעות ערכת טיהור RNA ייעודית (Table of Materials).
    1. הוסף X μL של תמיסת elution לתערובת תגובת mRNA משלב 2.10. מערבבים על ידי היפוך 5 פעמים. הוסף 300 μL של תרכיז תמיסת קשירה. מערבבים על ידי פיפטינג עדין 5 פעמים.
      הערה: X הוא הנפח הרזרבי לנפח כולל של 100 μL. לדוגמה, הוסף תמיסת אלוציה של 40 μL לתערובת תגובת mRNA של 60 μL.
    2. הוסף 100 μL של אתנול ללא RNAase. מערבבים על ידי פיפטינג עדין 5 פעמים.
    3. מקם עמודת מסנן באחד מצינורות האיסוף שסופקו. העבירו את תערובת תגובת ה-mRNA בעדינות למרכז המסנן מבלי לגעת במסנן. צנטריפוגה במהירות 15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר (RT).
    4. הרימו בזהירות את עמודת המסנן והשליכו את הזרימה בצינור האיסוף. החזירו את עמודת המסנן לאותה צינור איסוף.
    5. הוסף 500 μL של תמיסת כביסה (אל תשכח להוסיף 20 מ"ל אתנול ללא RNAase לפני השימוש בתמיסת הכביסה בפעם הראשונה).
    6. צנטריפוגה במהירות 15,000 x גרם למשך דקה אחת ב-RT. חזור על שלבים 3.1.4-3.1.6 כדי לשטוף פעם נוספת.
    7. צנטריפוגה במהירות מלאה (17,900 x גרם) למשך דקה אחת ב-RT כדי להסיר שאריות נוזל מעמודת המסנן. קח בזהירות את עמודת המסנן מצינור האיסוף. מקם את עמודת המסנן בצינור איסוף חדש.
    8. הוסף 50 μL של חיץ elution למרכז המסנן מבלי לגעת בפילטר. יש לדגור בטמפרטורה של 65°C למשך 10 דקות על מערבל תרמי.
    9. צנטריפוגה ב 15,000 x גרם למשך דקה אחת ב- RT. הסר את עמודת המסנן והשלך אותה.
  2. למדוד את הריכוז והטוהר של mRNA מדולל, לדוגמה, באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח כדי למדוד ספיגה ב 260 ו 280 ננומטר.
    הערה: יחס A260/A280 של 1.8-2.1 מעיד על mRNA מטוהר מאוד.
  3. ודא את נוכחותו של מוצר יחיד, אורך תעתיק נכון וזנב פולי(A) על-ידי ניתוח האליציטוטים משלבים 2.5 ו-2.7 על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז בתנאי דנטורינג (לדוגמה, השתמש בג'ל אגרוז 1.2% המכיל 20 mM 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid [MOPS], 5 mM נתרן אצטט, 1 mM חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA) ו-20% פורמלדהיד והפעל ב-20 mM MOPS, 5 mM נתרן אצטט, 1 mM EDTA ו 0.74% פורמלדהיד בזרם קבוע 100 V).
  4. אחסנו את ה-mRNA המטוהר בצינור ה-elution בטמפרטורה של -80°C עד לטרנספקציה. אם משתמשים רק בכמויות נמוכות של mRNA עבור transfection, אז aliquot את mRNA כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים.
    הערה: mRNA יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C במשך כשנה אחת.

4. הכנת מקרופאגים

  1. המתת חסד עכברי C57/BL6 (משתמשים בעכברים מאותו המין ובגילאי 6-24 שבועות) על ידי פריקת צוואר הרחם.
    הערה: ניתן להשתמש באותם עכברים לבידוד מקרופאגים ראשוניים (PM) (שלב 4.2) וליצירת BMDM (שלבים 4.3 ו-4.4). לבידוד של PM יש להשתמש בשני עכברים לפחות. אם רק BMDM הם נוצרו עכבר אחד בדרך כלל מספיק.
  2. העשרה אימונומגנטית של מקרופאגים פריטוניאליים.
    1. מלא מזרק 10 מ"ל עם צינורית 0.9 x 40 מ"מ עם 8 מ"ל של מלוחים חוצצים פוספט קר כקרח (PBS) ו 2 מ"ל של אוויר. לשטוף את חלל הצפק עם PBS. האוויר ייצור בועה שתמזער את הדליפה של PBS.
    2. לאסוף במהירות שטיפת הצפק עם אותו מזרק ולהעביר אותו לתוך 50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטית. שלבו תאי צפק של עכברים מרובים במידת הצורך. שמור על תרחיף התא על קרח.
    3. תרחיף תאי צנטריפוגה ב 650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 5 מ"ל של 0.2 % NaCl במשך 30 s כדי lyse כדוריות דם אדומות.
    4. הוסף 5 מ"ל של 1.6% NaCl לנפח כולל של 10 מ"ל כדי לשחזר תנאים איזוטוניים. צנטריפוגה ב 650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
    5. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את כדורית התא ב-97.5 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים מגנטי (MCS) (2 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA], 0.5% אלבומין בסרום בקר [BSA] ב-PBS) לכל שטיפה פריטוניאלית אחת (למשל, אם שלושה עכברים היו סמוקים, יש להשהות מחדש ב-292.5 μL).
    6. הוסף 2.5 μL של חרוזים פאראמגנטיים מצומדים לנוגדן ספציפי CD11b לכל 97.5 μL של תרחיף תאים (למשל, להוסיף 7.5 μL ל 292.5 μL).
    7. דגירה על קרח במשך 15 דקות ב-150 סל"ד בשייקר מסלולי.
    8. תרחיף תאי צנטריפוגה ב 650 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant, ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של מאגר MCS.
    9. הוסף 4 מ"ל של חיץ MCS לנפח כולל של 5 מ"ל ושטוף את התאים על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה שלוש פעמים.
    10. חזור על שלבים 4.2.8 ו- 4.2.9 פעמיים נוספות ובסך הכל שלושה שלבי שטיפה.
    11. במהלך שלבי השטיפה, הניחו עמוד LS במפריד תאים מגנטי (ראו טבלת חומרים). שטוף את העמוד עם 3 מ"ל של מאגר MCS.
      הערה: הימנע מבועות מכיוון שהן עלולות לסתום את העמודה.
    12. השהה מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של מאגר MCS. הוסף 3 מ"ל של מאגר MCS לנפח כולל של 4 מ"ל, וערבב על ידי פיפטציה למעלה ולמטה שלוש פעמים.
    13. העבר את 4 מ"ל של תרחיף התא לעמודת LS השטופה.
      הערה: שוב, הימנע מבועות מכיוון שהן עלולות לסתום את העמודה.
    14. המתן עד שהמאגר של העמודה יהיה ריק לחלוטין. אין להוסיף נוזל נוסף עד שהעמוד מפסיק לטפטף.
    15. הוסף 3 מ"ל של מאגר MCS לעמודה. לאחר מכן, המתן עד שהמאגר של העמוד יהיה ריק לחלוטין. חזור על שלב 4.2.15 פעמיים נוספות.
    16. מקם את עמוד LS בצינור צנטריפוגה חרוטי של 15 מ"ל. החל 5 מ"ל של מאגר MCS על העמודה. המתן עד 2 מ"ל של נוזל עבר דרך העמודה, ולאחר מכן השתמש בבוכנה כדי לדחוף בעדינות את החלק הנותר לתוך הצינור.
    17. מתלה תאי צנטריפוגה ב 650 x גרם למשך 5 דקות ב 4 ° C ולהשליך את supernatant.
    18. יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של מדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו בתוספת 10% נסיוב עגל עובר מומת בחום (FCS) (DMEM+FCS).
    19. קבע את מספר התאים בני קיימא על ידי ספירה בתמיסה כחולה טריפאן בתא ספירה של נויבאואר ותאי זרעים ב- DMEM + FCS ללוחות תרבית.
      הערה: זרע PM בצפיפות של 100,000 תאים/באר בלוח מיקרוטיטר תחתון שטוח. אין להשתמש בצלחות המטופלות בתרבית רקמה מכיוון שלא ניתן לנתק אותן מהן. השתמשו במקום זאת בצלחות שאינן מטופלות.
  3. דור BMDM
    1. הסר עור ושרירים מהרגליים האחוריות באמצעות זוג מספריים. שטפו כל רגל בטבילה קצרה באתנול 70%.
    2. נתקו את הרגליים ופתחו את שני קצוות עצם הירך והשוקה, על ידי חיתוך במספריים.
    3. ממלאים מזרק 5 מ"ל מלא בצינורית 0.6 מ"מ x 30 מ"מ עם 5 מ"ל של אנדוטוקסין נמוך מאוד (VLE) RPMI 1640 ושוטפים את מח העצם מהעצמות הפתוחות לצלחת תרבית.
    4. שלב את מח העצם של עכברים מרובים במידת הצורך על ידי חזרה על שלבים 4.3.1-4.3.3. מעבירים את מח העצם לצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מ"ל.
    5. צנטריפוגה את מתלה מח העצם ב 650 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו להשליך את supernatant.
    6. יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-5 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים (8.3% אמוניום כלורי, NH4Cl, 0.1 M Tris) ולדגור במשך 5 דקות ב-RT כדי ליזה את תאי הדם האדומים.
    7. צנטריפוגה את מתלה התא ב 650 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ו להשליך את supernatant.
    8. יש להשהות מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של VLE Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium בתוספת 10% FCS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% HEPES, 1% נתרן פירובט ו-10 ng/mL גורם מגרה מושבת מקרופאגים רקומביננטי (M-CSF) (RPMI+++++).
    9. הוסף 4 מ"ל של RPMI+++++ לנפח כולל של 5 מ"ל.
    10. הכינו 5 92 מ"מ x 16 מ"מ צלחות פטרי לא מטופלות עם מצלמות (ראו טבלת חומרים) לכל עכבר על ידי החדרת 7 מ"ל סל"ד+++++ בינוני לכל מנה.
    11. מעבירים את 1 מ"ל של תמיסת התא ל-5 צלחות התרבית המוכנות ודגרים ב-37°C ו-5% CO2.
    12. לאחר 4 ימים, להזין את התאים על ידי הוספת 4 מ"ל של RPMI+++++. לאחר 6-7 ימים, תאי מח העצם מתמיינים במלואם ל- BMDM.
  4. קציר BMDM
    1. הסר לחלוטין את המדיום ממנות התרבות. הוסף 5 מ"ל של 0.2 מ"ל EDTA חם ב- PBS לכל מנה.
    2. מגרדים בעדינות את הצלחת כולה עם מגרד תאים כדי לנתק את BMDM. שלב את מתלי התא בצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מ"ל.
    3. שוטפים שוב את כל 5 המנות. השתמש באותו נפח של 5 מ"ל של חם 0.2 mM EDTA ב PBS עבור כל 5 מנות. שלב את השעיית התא הזו עם זו מהשלב הקודם.
    4. צנטריפוגו את מתלה התא ב 650 x גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.
    5. יש להשהות מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של מדיום VLE RPMI 1640 בתוספת 10% FCS, 1% HEPES, 1% נתרן פירובט ו-10 ng/mL רקומביננטי M-CSF אך ללא אנטיביוטיקה (RPMI++++).
    6. קבע את מספר התאים בני קיימא על ידי ספירה בתמיסה כחולה טריפאן בתא ספירה של נויבאואר ותאי זרעים ב- RPMI++++ ללוחות תרבית.
      הערה: זרע BMDM בצפיפות של 50,000 תאים / באר מקסימלית בצלחת microtiter תחתית שטוחה. אין להשתמש בצלחות המטופלות בתרבית רקמה מכיוון שבקושי ניתן לנתק BMDM מהן. השתמשו במקום זאת בצלחות שאינן מטופלות.

5. העברה של מקרופאגים עם mRNA

  1. חשב את הנפח הנדרש של מאגר התמרת mRNA.
    הערה: נפח חיץ הטרנספקציה mRNA הנדרש תלוי בגודל הבאר: השתמש ב- 200 μL להעברה בצלחת 6 בארות, 100 μL בצלחת בת 12 בארות וכן הלאה. תמיד להוסיף קצת נפח רזרבי בגלל אובדן צנרת (אבל לא יותר מדי, כדי למנוע דילול מיותר של mRNA). לדוגמה, השתמש 450 μL במקום 4 x 100 μL = 400 μL כדי להדביק 4 בארות של צלחת 12 בארות.
  2. חשב את הנפח הנדרש של מגיב transfection mRNA. מגיב הטרנספקציה mRNA מתווסף ביחס של 1:50. לדוגמה, 9 μL של מגיב transfection mRNA נדרש עבור נפח סופי של 450 μL.
  3. חשב את הסכום הכולל של mRNA הנדרש. לפחות 100 ננוגרם לכל 100,000 מקרופאגים נדרשים להעברה יעילה, 200 ננוגרם עובדים אפילו טוב יותר (למשל, 800 ננוגרם mRNA כדי להדביק 400,000 מקרופאגים).
    1. הכפל את הכמות המחושבת של mRNA הנדרשת עם המספר הכולל של בארות שיש להדביק (למשל, 4 בארות עם 400,000 מקרופאגים כל אחת: 4 x 800 ng = 3,200 ng mRNA נדרש בסך הכל עבור כל הבארות). לדוגמה, אם מלאי ה-mRNA שלך הוא 426.8 ננוגרם/μL, יש צורך ב-7.49 מיקרו-ליטר להעברה אופטימלית של 4 בארות עם 400,000 מקרופאגים כל אחת.
  4. הוסף את הנפח המחושב של מאגר התמרת mRNA (שלב 5.1.) פחות הנפחים עבור מגיב טרנספקציה mRNA (שלב 5.2) ואת mRNA (שלב 5.3) לצינור תגובה. לדוגמה, 450 μL - 9 μL - 7.49 μL = 433.51 μL.
  5. הפשירו את ציר ה-mRNA וערבבו אותו על ידי היפוך עדין של צינור האלוציה. הוסף את הנפח המחושב של mRNA (שלב 5.3) לצינור התגובה עם מאגר תגובת mRNA (בדוגמה שהוצגה לעיל: 7.49 μL ב- 433.51 μL).
  6. מערבולת במשך 5 שניות וסחרור כלפי מטה במשך 2 שניות במהירות של 2,000 x גרם.
  7. מערבל את מגיב הטרנספקציה mRNA במשך 5 שניות ומסתובב כלפי מטה במשך 2 שניות ב 2,000 x גרם.
  8. הוסף את הנפח המחושב של מגיב טרנספקציה mRNA (שלב 5.2) לצינור התגובה המכיל את מאגר הטרנספקציה mRNA ואת ה- mRNA (בדוגמה שהוצגה לעיל: 9 μL של מגיב טרנספקציה mRNA).
  9. מערבלים את תערובת הטרנספקציה במשך 5 שניות ומסתובבים כלפי מטה במשך 2 שניות ב 2,000 x גרם.
  10. דגירה במשך 15 דקות ב- RT.
  11. בינתיים, החליפו את מדיום התרבית של המקרופאגים במדיום תרבית רענן וחם (ראו שלבים 4.2.18 ו-4.4.5).
  12. לאחר שלב הדגירה 5.10, הוסף את תערובת הטרנספקציה לבארות המכילות את המקרופאגים בנפח המתאים לגודל הבאר (ראה שלב 5.1). מוסיפים את תערובת הטרנספקציה במעגל מבחוץ לאמצע הבאר.
  13. נענעו בעדינות את הצלחת, תחילה אנכית ולאחר מכן בכיוון אופקי כדי להבטיח פיזור אחיד של תערובת הטרנספקציה בבאר. לאחר מכן, לדגור ב 37 ° C ו 5% CO2. סינתזה של החלבון המקודד על ידי mRNA נגוע יתחיל זמן קצר לאחר transfection. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, יש לדגור במשך 6 שעות לפחות.
  14. לאחר הדגירה, נתח את יעילות הטרנספקציה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (חיסוני), ציטומטריית זרימה או אימונובלוט, או השתמש במקרופאגים הנגועים לניסוי לפי בחירה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
5-מתיל-CTP (100 מילימול)ג'נה ביוזינסNU-1138Sמאוחסן ב -20 °C
פוספטאז אנטארקטימעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדM0289מאוחסן ב -20 °C
חיץ תגובת פוספטאז אנטארקטי (10X)מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדB0289מאוחסן ב -20 °C
נוגדן נגד NEMO/IKKγInvitrogenMA1-41046מאוחסן ב -20 °C
נוגדן אנטי-β-אקטיןסיגמא-אולדריץ'A2228מאוחסן ב -20 °C
צלחות פטרי 92,16 מ"מ עם מצלמותזארשטדט8,21,473מאוחסן ב- RT
CD11b Microbeads עכבר ואדםMiltenyi ביוטק130-049-601מאוחסן ב-4°C
Cre recombinase + פריימר קדמי T7-Promotorסיגמא-אולדריץ'5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3', מאוחסן ב-20°C
Cre recombinase + T7-Promotor פריימר הפוךסיגמא-אולדריץ'5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, מאוחסן ב-20°C
ערכת טיהור DNA: ערכת טיהור PCR מהירה QIAfastקיאגן28104מאוחסן ב- RT
פריימר קדמי eGFP + T7-Promotorסיגמא-אולדריץ'5'-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3', מאוחסן בטמפרטורה של -20°C
eGFP + T7-Promotor פריימר הפוךסיגמא-אולדריץ'5'-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3', מאוחסן ב-20°C
מאגר Fast Digest (פי 10)תרמו סיינטיפיקB64מאוחסן ב -20 °C
FastDigest XbaIתרמו סיינטיפיקFD0684מאוחסן ב -20 °C
פולימראז באיכות גבוהה עם הגהה: Q5 DNA-פולימראז באיכות גבוההניו אינגלנד Biolabs IncM0491Sמאוחסן ב -20 °C
IKKβ + פריימר קדמי T7-Promotorסיגמא-אולדריץ'5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, מאוחסן בטמפרטורה של -20°C
IKKβ + T7-Promotor פריימר הפוךסיגמא-אולדריץ'5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, מאוחסן ב-20°C
ערכת שעתוק mRNA במבחנה: ערכת HiScribe T7 ARCA mRNA (עם זנב polyA)מעבדות ביולוגיות של ניו אינגלנדE2060מאוחסן ב -20 °C
עמודות LSMiltenyi ביוטק130-042-401מאוחסן ב- RT
MACS MultiStandMiltenyi ביוטק130-042-303מאוחסן ב- RT
מאגר ומגיב טרנספקציה mRNA: jetMESSENGERטרנספקציה פוליפלוס409-0001DEמאוחסן ב-4°C
פלסמיד IKKβ IKK-2S177/181E מוטנטיאדג'ין11105מאוחסן ב -20 °C
פלסמיד מוטנטי NEMOC54/347Aאדג'ין27268מאוחסן ב -20 °C
פלסמיד pEGFP-N3אדג'ין62043מאוחסן ב -20 °C
פולי(I:C)קלביוכם528906מאוחסן ב -20 °C
פלסמיד pPGK-CreF. T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, גרסאות חדשות של recombinase Cre מושרה: מוטציה חדשה של חלבון היתוך Cre-PR מפגינה רגישות מוגברת וטווח מורחב של השראות. חומצות גרעין Res. 29, 47e (2001). מאוחסן ב -20 °C
Pseudo-UTP (100 mM)ג'נה ביוזינסNU-1139Sמאוחסן ב -20 °C
מפריד QuadroMACSMiltenyi ביוטק130-090-976מאוחסן ב- RT
עכבר נגד עכבר CD11b נוגדן, APC-מצומדביולג'נד101212מאוחסן ב-4°C
נוגדן F4/80 נגד עכבר עכבר, מצומד PEeBioscience12-4801-82מאוחסן ב-4°C
M-CSF רקומביננטיפפרוטק315-02מאוחסן ב -20 °C
ערכת טיהור RNA: ערכת ניקוי תמלול MEGAclearתרמופישר סיינטיפיקAM1908מאוחסן ב-4°C
פעילי שטח מפרקים RNAse: RnaseZAPסיגמא-אולדריץ'₪520מאוחסן ב- RT
LPS טהור במיוחד מ-E.coli O111:B4אינוויווגןמאוחסן ב -20 °C
פלסמיד IKKβ מסוג פראיאדג'ין11103מאוחסן ב -20 °C
פלסמיד NEMO מסוג פראיאדג'ין27268מאוחסן ב -20 °C

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

mRNAmRNA

מאמרים קשורים