הערה: הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הדרושים לסילוק תאים ספציפיים באמצעות פוטואימונותרפיה אינפרא אדום קרוב (NIR-PIT). בקרות ופרטים אחרים על NIR-PIT וכדאיות התא ניתן למצוא במקומות אחרים.
1. צימוד אינפרא אדום 700 (IR700) לנוגדנים חד-שבטיים (mAb)
- הכינו mAb של עניין ב 2-5 מ"ג / מ"ל ב 0.1 M דיסודיום מימן פוספט (Na2HPO4) (pH 8.6) פתרון.
- יש לערבב 6.8 nmol של mAb עם 30.8 nmol של 10 mM IR700 בתמיסת 0.1 M Na2HPO4 (pH 8.6) בצינור מיקרוצנטריפוגה ולדגור ב-RT למשך שעה אחת, מכוסה ברדיד אלומיניום.
- שטפו את עמודת PD-10 (ראו טבלת חומרים/ציוד) ב-PBS של 15 מ"ל, פעמיים. טען את הדגימה משלב 1.2.
- לטהר את התערובת באמצעות עמודת PD-10 על ידי PBS elution בהתאם להוראות היצרן.
הערה: כאן, האלוטיון היה לאורך צבע הרצועה של IR700. עבור דגימה של 300 μl, מקטע אלוציה PBS הוא בדרך כלל בין 2.5 מ"ל ל 4.4 מ"ל.
- קבע את ריכוז החלבון עם צביעת קומאסי על ידי מדידת הספיגה ב 595 ננומטר עם ספקטרופוטומטר. קבע את הריכוז של IR700 עם ספיגה ב 689 ננומטר כדי לאשר את מספר מולקולות פלואורופור מצומדות לכל מולקולת mAb.
הערה: חשוב לקבוע מספר צימוד אופטימלי של מולקולות IR700 ב- 1 mAb עם ספקטרופוטומטר. באופן כללי, כ-3 מולקולות IR700 במולקולת mAb אחת הן אופטימליות הן לעבודה במבחנה והן בעבודה in vivo. ניתן להשתמש בשיטות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) ואלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל-סולפט (SDS-PAGE) כדי לאשר אם mAb ו- IR700 קשורים או לא.
- יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C לאחר קביעת ריכוז החלבון.
2. הכנת תרבית תאים תלת ממדית מעורבת (ספרואיד מעורב)
- יש למרוח מים סטריליים (כ-1 מ"ל) על מקטע מאגר הצלחת של צלחות הטיפה התלויות.
- הכינו יחסים שונים של סוגי התאים המעניינים – תאי חלבון פלואורסצנטי ירוק A431-luciferase-green (A431-luc-GFP) ותאי חלבון פלואורסצנטי אדום 3T3 (3T3-RFP) – כאשר כל דגימה מכילה 5,000 תאים בסך הכל, מרחפים ב-50 מיקרוליטר של תרבית.
הערה: הכינו יחסים של 1:100, 10:100, 25:100, 50:100 וכו' של סוגי תאים בעלי עניין במדיה תרבית בהתאם לסוג התא.
- דוגרים על התערובת במשך 5-7 ימים בצלחת הטיפה התלויה היטב 96 באינקובטור לח ב 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני. החליפו את מדיית התרבות כל יומיים. הערה: כדי ליצור את הספרואיד התלת-ממדי במדויק, טפל בצלחת בעדינות, מכיוון שטיפות המכילות תאים נופלות בקלות לפני היוצרות צורות תלת-ממדיות.
- התבונן במורפולוגיה ובגודל של הספרואידים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך בהגדלה של 10X - 40X. הערה: למרות שזה תלוי בסוגי התאים ובגודל הטיפה התלויה, ודא שקוטר הספרואיד הוא סביב 400-600 מיקרומטר לאחר 7 ימי דגירה בלוח הטיפה התלוי היטב 96.
3. NIR-PIT במבחנה לתרבית תאים תלת-ממדית מעורבת
- החליפו את המדיה של לוחות הטיפה התלויים ל-10 מיקרוגרם/מ"ל נוגדנים-פוטובולפטרים מצומדים (APC) המכילים מדיה, ודגרו במשך 6 שעות באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C ו-5% פחמן דו חמצני.
- לאחר 6 שעות דגירה, שטפו את הספרואיד פעמיים במצע תרבית טרי (ללא פנול אדום). מעבירים בעדינות את הספרואיד לצלחת בעלת תחתית זכוכית בקוטר 50 מ"מ עם תרבית תרבית אדומה ללא פנול טרי של 100 μl באמצעות קצה פיפטה סטרילי של 200 μl עם קצה חתוך. מניחים ספרואיד אחד בכל צלחת.
- התבונן בכדוריד עם מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך כדי לזהות את השינוי במורפולוגיה. כדי לצפות בכתבים האופטיים (למשל, GFP ו-RFP) השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי עם הגדרות המסנן הבאות: GFP — מסנן עירור 469 ננומטר, ומסנן פליטה 525 ננומטר; RFP — מסנן עירור 559 ננומטר, ומסנן פליטה של 630 ננומטר.
- הניחו את הדיודה פולטת האור (LED) מעל הצלחת בעלת תחתית הזכוכית לצורך הקרנה.
הערה: ספרואידים יכולים להיחשף לאור NIR במיקרוסקופ או במכסה המנוע הלמינרי.
- מדוד את צפיפות ההספק של אור NIR באמצעות מד הספק אופטי. על פי מדידה זו, מקרינים אור NIR באמצעות דיודות פולטות אור (LED) הפולטות אור באורכי גל של 670 עד 710 ננומטר ב-2 J/cm2.
הערה: נורית LED יכולה לחדור לעומק מרבי של כ-5 אינץ'. ההשפעות ציטוטוקסיות של NIR-PIT תלויות רק באנרגיה נתונה, ללא קשר לצפיפות ההספק ולמשך החשיפה.
- לאחר ההקרנה, מעבירים את הספרואיד לצלחת טיפה תלויה חדשה עם 50 מיקרוליטר של מדיה תרבית טרייה ודגרים במשך יום אחד באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ופחמן דו חמצני 5%.
- העבירו בעדינות את הספרואיד לצלחת בעלת תחתית זכוכית עם 100 מיקרוליטר של מצע תרבית טרי (ללא פנול אדום) באמצעות קצה פיפטה סטרילי של 200 μl עם קצה חתוך. התבונן בכדורואיד במיקרוסקופ פלואורסצנטי יום אחד לאחר NIR-PIT באמצעות הגדרות מסנן המתוארות בשלב 3.3.
- זהו תאים מתים על-ידי הוספת פרופידיום יודיד למדיה בריכוז סופי של 2 מיקרוגרם/מ"ל, או על-ידי אובדן ציטופלזמי של GFP-פלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1B).
- חזור על שלבים 3.1-3.6 אם תאי היעד לא בוטלו לחלוטין.
