בידוד תאי גזע המטופויטיים מדם טבורי ליצירת עכברי מערכת החיסון האנושית

תקציר

מקור: Lanis, J. M., et al. בדיקת אימונותרפיה לסרטן במודל עכבר אנושי הנושא גידולים אנושיים. J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת עכברי מערכת החיסון האנושית (HIS). CD34⁺ תאי גזע hematopoietic (HSC) מבודדים מתאי מעיל דם טבורי אנושי באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים. CD34⁺ HSCs מורחבים במדיום גידול מועשר בציטוקינים ונשמר בהקפאה. לבסוף, HSCs מופשרים מוזרקים לתוך גור עכבר מדוכא חיסון כדי לבסס את מודל העכבר שלו.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון. כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. דור העכברים שלו

1. גידול עכברים של BALB/c -Rag2^null Il2RγC^null Sirpα^NOD (BRGS) עכברים
   הערה: זן זה הוא בעל כשל חיסוני קיצוני, ללא תאי T, B או הרג טבעי (NK). לכן, יש להשתמש באמצעים מחמירים כדי למנוע זיהומים אופורטוניסטיים. לשמור על המושבה על דיאטה המכילה trimethoprim ו sulfadiazine על לוח זמנים לסירוגין 2 שבועות עם דיאטה רגילה. יש לשמור על חדר דיור ברמת הזהירות הגבוהה ביותר האפשרית (למשל, מתקן מקלחת מחסום עם גישה מוגבלת).
   1. שמור על מושבות של עכברי BALB/c -Rag2^null Il2RγC^null Sirpα^NOD (BRGS) ו- BALB/c Rag2^null Il2RγC^null Sirpa^Balb/c (BRG) עכברים הומוזיגוטיים כמגדלים.
   2. גזע BRGS^N/N×BRG^B/B כדי ליצור גורי BRGS^B/N, שישמשו כמושתלים של תאי גזע אנושיים. במושבה זו, BRGS^B/N בריאים יותר מ-BRGS^N/N, ומשתלים ברמות שוות ערך (יותר מ-BRG).
2. CD34+ בידוד תאי גזע אנושיים מדם טבורי (CB)
   הערה: לא נעשה שימוש באנטיביוטיקה עבור הליך זה. לכן, טכניקה סטרילית טובה היא הכרחית.
   1. הניחו מתלה צינורות חרוטי 50 מ"ל, כמו גם צינורות חרוטיים 3x 15 מ"ל ו~ 10x 50 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית מעוקר (BSC). רססו שקית איסוף דם עם 70% אתנול ותנו לה להתייבש ב-BSC.
   2. חשב את מספר הצינורות החרוטיים של 50 מ"ל הדרושים לבידוד שיפוע צפיפות CB = נפח CB/15, מעוגל כלפי מעלה למספר צינור זוגי. חישוב נפח דם לצינור = נפח CB / מספר צינורות. יוצקים דם בזהירות משקית CB לכל צינור חרוט; זהו מקסימום של 15 מ"ל לכל צינור. השתמש פיפטור אוטומטי פיפטה סרולוגית 25 מ"ל כדי לערבב את הדם 1: 1 עם PBS סטרילי על ידי pipeting למעלה ולמטה.
   3. השתמש בפיפטטור אוטומטי במהירות נמוכה ופיפטה סרולוגית של 10 מ"ל כדי לכסות את הדם באיטיות בתמיסת שיפוע צפיפות של 1.077 גרם / מ"ל בטמפרטורת החדר (ראה טבלת חומרים) מבלי להפריע לממשק. שמור על קצה פיפטה מלגעת בתחתית הצינור. חזור על הפעולה עבור כל הצינורות. לאחר מכן צנטריפוגה למשך 30 דקות במהירות 850 x גרם, ללא בלימה, ב- RT כדי להבטיח שמירה על שיפוע הצפיפות.
   4. דמיינו את שכבת הבאפי התאית על גבי שיפוע הצפיפות של 1.077 גרם/מ"ל כשכבה לבנה עכורה. יש להסיר ולהשליך את שכבת הפלזמה עד לכ-10 מ"ל מעל הפרווה הבאפית באמצעות פיפטה סרולוגית בנפח 25 מ"ל ופיפטור אוטומטי.
   5. אספו את המעיל האפי עם העברה סטרילית או פיפטה סרולוגית. השתמש פיפטה כמו מרית כדי לגרד את התאים מהצד של צינור חרוטי תוך שחרור הנורה (או pipetting לאט) כדי למשוך את התאים למעלה. שלב את המעילים הבאפיים משני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל לצינור חרוטי חדש אחד של 50 מ"ל.
   6. שטפו את התאים על ידי שפיכת 45 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת סטרילית של הנקס (HBSS) המכילה 2% סרום בקר עוברי (FBS) לכל צינור חרוט. צנטריפוגה למשך 11 דקות ב 360 x גרם ב RT.
   7. יש לשאוף את אמצעי השטיפה עד לגלולה בכל הצינורות. השתמש פיפטה סרולוגית 10 מ"ל פיפטור אוטומטי כדי להשעות מחדש את הגלולה הראשונה ב 10 מ"ל של HBSS המכיל 2% FBS. השהה מחדש כל גלולה באותו 10 מ"ל של HBSS, ושטוף כל צינור עם 10 מ"ל נוספים של HBSS כדי לאסוף את כל התאים לתוך צינור אחד.
   8. יוצקים 45 מ"ל של HBSS סטרילי המכיל 2% FBS בצינור החרוט. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 360 x גרם, ב 4 ° C.
   9. שאפו את חיץ השטיפה עד לגלולת התא והשעו מחדש את הגלולה ב-20 מ"ל של מאגר מפריד תאים מגנטי (ראו טבלת חומרים). הסר aliquot קטן כדי לספור את התאים עם hemacytometer בדילול 1:20 בכחול methylene. הוסף את מספר התאים הכחולים והלבנים. צנטריפוגה ב-360 x גרם, למשך 10 דקות ב-4°C.
      הערה: פרוטוקול זה משתמש בטכנולוגיית חרוזים מגנטיים (ראה טבלת חומרים). ניתן לשנות את הפרוטוקול לשימוש עם כל טכנולוגיית הפרדת תאים, עם טוהר ותנובה מספיקים של תאי גזע CD34+.
   10. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא CD34+ שבודדה מדם טבורי ב 300 מיקרוליטר של מאגר מפריד תאים מגנטי לכל 1 x 10⁸ תאים. הוסף 100 μL של קולטן Fc (FcR) מגיב חוסם תחילה, ולאחר מכן 100 μL של CD34+ חרוזים מגנטיים לכל 1 x 10⁸ תאים. יש לדגור בטמפרטורה של 4°C למשך 30 דקות (ללא קרח).
   11. הוסף 5 מ"ל של מאגר מפריד תאים מגנטי לכל 1 x 10⁸ תאים וסחרור ב 360 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. חזור על שלב השטיפה והשהה מחדש את הגלולה ב 500 μL של מאגר מפריד תאים מגנטי לכל 1 x 10⁸ תאים בצינור חרוטי 15 מ"ל שכותרתו "unfractionated".
   12. תווית שני צינורות חרוטי 15 מ"ל נוספים "CD34-" ו "CD34+". הניחו את שלושת הצינורות החרוטיים בנפח 15 מ"ל (ללא הפרקציה, CD34 ו-CD34+) לחריצים A1, B1 ו-C1, בהתאמה, על מדף קירור (ראו טבלת חומרים). הפרד את התאים באמצעות תוכנית הבחירה החיובית בת שתי העמודות במפריד תאים מגנטי אוטומטי (ראה טבלת חומרים) ב- BSC, בהתאם להוראות המכשיר של היצרן.
3. הרחבה והקפאה של תאי גזע אנושיים CD34+
   1. Aliquot 10 μL של תרחיף התאים CD34+ התאושש (2 מ"ל) על שקופית hemocytometer ולספור את התאים תחת הגדלה 10x. חשב את המספר הכולל של תאי CD34+ על ידי הכפלת ספירת התאים ב- 2 x 10⁴. חלק את מספר התאים הכולל של CD34+ ב- 250,000 כדי לחשב את מספר הבקבוקונים להקפאה (50,000 תאים לכל גור עכבר לפני הרחבת המבחנה).
   2. הכינו את סרום העגל העוברי 10% (FCS) של CB medium Iscove (בתוספת 1 מ"ל נוסף לאובדן סינון), בתוספת גורם תאי גזע 40 ng/mL, 20 ng/mL טירוזין קינאז 3 ליגנד דמוי FMS (Flt3L) ו-10 ng/mL אינטרלוקין-6 (IL-6), ועברו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. להשעות מחדש את תאי CD34+ ב 100,000 לכל מ"ל של CB בינוני, ולדגור ב 37 ° C. ביום השלישי, הוסף נפח שווה ערך של מדיום CB ללא ציטוקינים לבקבוק המכיל את התאים ואת תווך CB עם ציטוקינים.
      הערה: הוספת ציטוקינים אלה למדיום CB מקדמת הישרדות והרחבה של תאי CD34+ תוך מניעת התמיינות.
   3. קצור את תאי CD34+ המורחבים ביום 5. פיפטה את תרחיף התא למעלה ולמטה ולאסוף בצינור חרוטי 50 מ"ל. מוסיפים מספיק CB בינוני כדי לכסות את החלק התחתון של הצלוחית. באמצעות מגרד התא, לגרד את כל החלק התחתון של הצלוחית. אסוף את כל המדיה לתוך אותו צינור 50 מ"ל, וצנטריפוגה ב 360 x גרם במשך 11 דקות.
   4. להשעות את התאים ב 2 מ"ל של מדיום CB. שומרים את הטיפה האחרונה מהפיפטה לצלחת של 96 בארות לספירה. לדלל את התאים 1:1 בכחול טריפאן ולהוסיף 10 μL להמאציטומטר, ולאחר מכן לספור וממוצע תאים מארבעה רבעים. חשב את המספר הכולל של תאי CD34+ על ידי הכפלת ספירת התאים ב- 4 x 10⁴, ורשום את הכדאיות.
   5. צור n+1 מ"ל של מדיום הקפאה, כאשר n הוא מספר בקבוקוני ההקפאה המחושב בשלב 1.3.1. הכינו מדיום הקפאה על ידי הוספת 10% (v/v) dimethyl sulfoxide (DMSO) ל-FBS ושמרו על קרח. תייג את הקריובלים עם CB#, CD34+ d5 ותאריך.
   6. סובב את תאי CD34+ ב 360 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. לשאוף את המדיום עד הגלולה ולהשהות מחדש את גלולת התא בתווך הקפאה. Aliquot 1 מ"ל של תרחיף תאים לכל בקבוקון ולחלק כל שארית שווה בין הבקבוקונים. הוסיפו את הבקבוקונים למקפיא תאי איזופרופנול מקורר ל-4°C, הניחו בטמפרטורה של -80°C והעבירו לחנקן נוזלי לאחסון למשך >90 יום.
4. הקרנה של גורי עכברים
   1. אספו את גורי BRGS^B/N, 1-3 ימים לאחר ההמלטה, לתוך קופסת פלסטיק אוטוקלאבית עם ריפוד. הוסיפו כמות קטנה של מצעים עם הגורים. תייגו את הקופסה עם מספר הכלוב ומספר הגורים.
   2. הגדר את המקרין (ראה טבלת חומרים) למנה של 300 ראד. הכנס את קופסת הגורים למקרין וחשוף אותם ל- 300 ראד. החזירו את הגורים לכלוב, הניחו אותם בערימה וכסו אותם במצעים.
5. זריקות גור והכנת תאי CD34+
   1. התחל הכנת תאים CD34+ ~ 3 שעות לאחר הקרנה. חם 10 מ"ל של מדיה CB בצינור חרוטי 50 מ"ל. בצע את כל השלבים ב- BSC סטרילי.
   2. אחזר בקבוקון אחד של תאי CD34+ מורחבים וקפואים במבחנה עבור כל ארבעה עד שישה גורים להזרקה. הפשירו במהירות ב-55°C, עד שניתן יהיה לראות רק כמות קטנה של קרח, והוסיפו את התאים לתווך CB המחומם (הבקבוקון עדיין צריך להיות קריר למגע). השתמש 1 מ"ל של בינוני כדי לשטוף כל בקבוקון ולסובב את התאים ב 360 x גרם במשך 12 דקות ב 4 ° C.
      הערה: הפשרה מהירה ב-55°C נמצאה כמניבה כדאיות תאים טובה יותר (90%-95%) מאשר הפשרה ב-37°C.
   3. שאפו את המדיום בזהירות. להשהות מחדש את הגלולה (הקטנה) ב 2 מ"ל של מדיה CB, לערבב בעדינות, ולהוסיף ~ 30 μL של תרחיף התא לבאר אחת בצלחת ספירה. לדלל 1:1 בכחול טריפאן, ולאחר מכן להוסיף 10 μL להמוציטומטר ולספור ולממוצע את התאים מארבעה רבעים.
   4. חשב את המספר הכולל של תאי CD34+ על ידי הכפלת ספירת התאים ב- 4 x 10⁴ ולאחר מכן רשום את הכדאיות. סחור ב 360 x גרם במשך 12 דקות ב 4 ° C.
   5. שאפו את התווך בזהירות והשעו מחדש את כדורית התא ב-100 מיקרוליטר של PBS סטרילי לכל n+1 גורים להזרקה, והתוצאה היא 250,000-450,000 תאי CD34+ לכל עכבר. מניחים את הצינור החרוטי על קרח במיכל הובלה ונוסעים לוויבריום להזרקת גורים.
   6. הביאו מנורת חום, חיתולים, מזרק 1 מ"ל, מחט 18 גרם, מחט 30 גרם והכנת תאי CD34+ במיכלים סטריליים לוויבריום BSC. מניחים חיתול סטרילי ~ 2 רגל מתחת למנורת החום. אחזרו את הכלוב עם החול להזרקה והניחו אותו ב-BSC.
   7. להרכיב את המזרק עם מחט משופעת 18 G. התאמת זווית הצינור החרוטי עם שיפוע המחט, מערבבים בעדינות ומושכים את מתלה התא. הניחו את הגורים על החיתול לחימום (שימו לב להתחממות יתר). הסר אוויר מהמזרק והחלף את מחט 18 גרם במחט 30 גרם, ולאחר מכן דחוף בזהירות את המזרק עד שתרחיף התא נמצא רק בקצה המחט.
      הערה: לחלופין, מזרק אינסולין ניתן להשתמש.
   8. קחו גור אחד בכל פעם לקצה החיתול הרחק ממנורת החום. יש לשתק את הגור על צדו מתחת לאגודל ולאצבע, ולאפשר מבט ברור על הפנים. שימו לב לווריד על פני הלחי מתחת למקום שבו האוזן תהיה. הכנס את המחט באופן רדוד לתוך הווריד (IV) הקרוב ביותר לעין, ולהזריק לאט 50 μL של תאים.
   9. בדוק אם נוצרת בועה מהזרקה תת עורית. אם כן, הכנס את המחט עמוק יותר והמשך להזריק תאים. טיפה קטנה של דם/המטומה תיראה לעין כאשר תצליח.
   10. כאשר הגור עדיין משותק, בצע זריקה תוך כבדית (IH) עם עוד 50 μL של תאים (100 μL סה"כ לכל גור של IV+IH). ניתן לדמיין את הכבד כנקודה כהה בין רצועת החלב הלבנה לכלוב בית החזה. הניחו את הגור המוזרק על חיתול רחוק יותר מהגורים שלא הוזרקו ומחממים.
       הערה: הזרקת IV מביאה לכימריזם טוב יותר לטווח ארוך מאשר הזרקת IH בלבד, אך זריקות IV לא תמיד מצליחות. לכן, פיצול ההזרקה בין IV ל-IH מבטיח קליטה לאחוז גדול יותר של עכברים.
   11. יש לחזור על זריקות וריד הפנים ו-IH לכל הגורים. נקו כל דם, החזירו גורים לקן בכלוב שלהם וכסו במצעים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מ"ל מזרק עם מחטים	מק'קסון	1031815
צינורות 15 מ"ל	גרנייה ביו-וואן	188271
2-מרקפטואתנול	סיגמא	M6250
צינורות 50 מ"ל	גרנייה ביו-וואן	227261
מפריד AutoMACS Pro	מילטני	130-092-545
BSA	פישר סיינטיפיק	BP1600100
צ'יל 15 מתלה	מילטני	130-092-952
תאי גזע עובריים FCS	גיבקו	10439001
צינורות אפנדורף; נפח 1.5 מ"ל	גרנייה ביו-וואן	616201
הצטיין	מיקרוסופט
פ.ב.ס.	אמת מידה	100-106 500 מ"ל
פיקול הייפאק	GE שירותי בריאות	45001752
פיפטות זכוכית	DWK מדעי החיים	63א53
HBSS עם Ca & מ"ג	סיגמא	55037ג
MultiRad 350	רנטגן מדויק
PBS	קורנינג	45000-446
פריזמה	Graphpad
Rec Hu FLT3L	מערכות מו"פ	308-FK-005/CF
Rec Hu IL6	מערכות מו"פ	206-IL-010/CF
Rec Hu SCF	מערכות מו"פ	255SC010
פיפטות סרולוגיות 25 מ"ל	פישר סיינטיפיק	1367811
מסנן סטרילי	נלג'ין	567-0020
מים מולקולריים סטריליים	סיגמא	7732-18-5
Yeti Cell Analyzer	ביו-ראד	12004279