$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. חיסון תאים
- הכנת תאים ובעלי חיים
- ודא שקו התא נשמר במדיה המומלצת. לדוגמה, לשמור על קו תאים WEHI 164 במכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) 1640 בינוני בתוספת 2 mM L-גלוטמין, 10% סרום בקר עוברי, 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), 0.05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U/mL פניצילין, ו 100 מיקרוגרם / מ"ל streptomycin.
הערה: תאי מעבר לפחות 3 ועד 5 פעמים לאחר הוצאתם מהאחסון הקריוגני. כדי להבטיח כדאיות תאים אופטימלית, יש לפצל תאים כאשר הם נמצאים בין 70-80% נפגשים. שורות תאי הגידול צריכות להיבדק עבור מיקופלסמה, שכן זיהום יכול לשנות את צמיחת התאים ולהשפיע על התגובה החיסונית in vivo.
- יום לפני החיסון, יש לגלח עכברים באגף הימני התחתון באמצעות clippers.
הערה: נקבות עכברי BALB/c, בגילאי 8-12 שבועות, במשקל תקין (16-22 גרם) שימשו בניסוי זה.
- ביום החיסון, לקצור WEHI 164 תאים כאשר 70-80% מתמזגים על ידי טריפסיניזציה.
- יש לשאוף את מדיום התרבית מצלוחיות תרבית הרקמה ולאחר מכן להוסיף תמיסה חוצצת פוספט סטרילית (1x PBS), כדי להסיר את העקבות הנותרים של נסיוב בקר עוברי (FBS).
- שאפו את PBS מצלוחיות תרבית הרקמה. הוסף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין (עבור בקבוק T75) ולאחר מכן מערבל את הבקבוק כך שכל פני השטח של בקבוק עם תאים מכוסה טריפסין.
- לדגור על הבקבוק ב 37 ° C, 5% CO2 אינקובטור במשך 3 דקות. בדוק תאים מעת לעת, על ידי הקשה על הצדדים של הבקבוק כדי לראות אם תאים נעקרו.
- הסר צלוחיות מאינקובטור תרבית תאים והוסף 5 מ"ל של מדיה בתוספת FBS כדי לנטרל את הטריפסין.
הערה: אל תשאירו תאים בטריפסין זמן רב יותר מהנדרש, שכן זה עלול לפגוע בתאים ולהוביל לכדאיות תאים נמוכה.
- מתלה פיפט מספר פעמים כדי להשיג השעיה של תא בודד. העברת תרחיף התא לצינור צנטריפוגה חרוטית.
- תאי גלולה על ידי סיבוב ב 350 x גרם במשך 3 דקות.
- שטפו את התאים שלוש פעמים ב-1x PBS.
- יש להשהות מחדש תאים ב-50 מ"ל של PBS סטרילי 1x ולשטוף תאים על ידי השעיית תאים מעלה ומטה. תאי גלולה על ידי סיבוב ב 350 x גרם במשך 3 דקות.
- לשאוף את supernatant ו resuspend תאים ב 15 מ"ל של סטרילי 1x PBS. יש לשטוף תאים על ידי השעיית תאים מעלה ומטה. תאי גלולה על ידי סיבוב ב 350 x גרם במשך 3 דקות.
- לשאוף את supernatant ו resuspend תאים בדיוק 10 מ"ל של סטרילי 1x PBS. לשטוף תאים כמו בשלב 1.1.4.2 ולהעביר כמות קטנה (כ 100 μL) של תרחיף התא לצינור צנטריפוגה לספירה. תאי גלולה על ידי סיבוב ב 350 x גרם במשך 3 דקות.
- קבע את מספר התא באמצעות שיטת ההדרה הכחולה של Trypan באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי. תאי השהיה מחדש ב- PBS סטרילי 1x בריכוז של 5 x 106 תאים / מ"ל. יש לשמור את תרחיף התאים על קרח.
הערה: הכדאיות של תאי הגידול צריכה להיות שווה או מעל 80% כדי להבטיח צמיחת גידול הניתנת לשחזור.
- חיסון תת עורי
- מערבבים היטב את תרחיף התא וממלאים מזרק במחט 26 גרם עם 100 μL של תרחיף תאים (5 x 105 תאים) בסטרילי 1x PBS. חזור על ערבוב התאים לפני טעינת המזרק הבא.
הערה: שמור תאים על קרח לאורך כל ההליך כדי לשמור על כדאיות.
- רסן את העכבר כראוי, וודא גישה לאגף הימני התחתון. חסן את העכבר תת עורית על האגף הימני התחתון המגולח.
הערה: ודא שהחיסון אינו בצפק על ידי הרמת המחט מעט, אשר אמור להיות גלוי מתחת לעור. גוש דמוי בועה אמור להיווצר מתחת לעור לאחר החיסון.
- יש לעקוב אחר עכברים כנדרש על פי אישור האתיקה הרלוונטי ולבצע כריתה כירורגית כאשר הגידולים גדלו לגודל של כ-50 מ"מ2.
2. כריתה כירורגית חלקית של הגידול
הערה: פרוטוקול זה דורש שני חוקרים; אחד עבור הליכים כירורגיים (מנתח), ואחד עבור ניטור עכבר (ASSISTANT).
- מערך הניתוח
- ביום ה-12 לאחר החיסון, כאשר הגידולים הגיעו לגודל של כ-50 מ"מ2, יש לתת מינון לעכברים עם 100 מיקרוליטר (0.1 מ"ג/ק"ג) של buprenorphine s.c. בצוואר, 30 דקות לפני הניתוח.
- מקמו את אזור הניתוח עם כרית חום מכוסה במעיל ספסל והציבו חרוט אף להרדמה. יש לעקר כלי ניתוח לפני השימוש, ובין כל בעל חיים באמצעות מעקר חרוזי חום, המאפשר לכלים להתקרר לפני השימוש. דאגו שהציוד הכירורגי הבא יהיה נקי ובהישג יד: כלורהקסידין, ספוגית, גזה, ג'ל עיניים, שני מלקחיים מעוקלים, מספריים, מוליך קליפס, מסיר קליפסים ומילוי קליפסים (איור 1A, 1B).
- חממו את תא החימום לטמפרטורה של 37°C והציבו כרית חום נוספת להתאוששות (איור 1C). הניחו כלים מעוקרים על משטח סטרילי כגון רפידות אוטוקלאביות.
- הרדמה
- הכניסו את העכבר לתא האינדוקציה והרדימו את העכבר עם 4% איזופלורן (4% ב-100% חמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה) עד שקצב הנשימה מאט לכ-60 נשימות לדקה (1 לשנייה) (זה בדרך כלל לוקח <1 דקות).
הערה: אל תשאיר את העכבר בתא זמן רב מדי, שכן הדבר עלול להוביל לחנק ולמוות. יש רק עכבר אחד תחת הרדמה בכל פעם.
- העבירו את העכבר על כרית החום שעל שולחן הניתוחים, הניחו את העכבר עם אפו בחרוט האף, ושמרו על מצב ההרדמה עם 3-4% איזופלורן ב-100% חמצן בקצב זרימה של 0.5 ליטר/דקה. עקבו אחר קצב הנשימה כדי לוודא שעומק ההרדמה נשמר.
הערה: על העוזר לפקח על נשימת העכבר לאורך כל הניתוח כדי להבטיח את רמת ההרדמה הנכונה. להוריד את ריכוז ההרדמה אם הנשימה נעשית איטית מדי או להגדיל את הריכוז אם עומק ההרדמה רדוד מדי. אם העכבר מתחיל להשתנק, הסר את העכבר מחרוט האף, הפחת את ריכוז ההרדמה והמתן עד שהנשימה תנרמל לפני שתניח שוב על חרוט האף.
- בצע "בדיקת צביטה" ו"בדיקת רפלקס קרנית" כדי לוודא שהעכבר מורדם לחלוטין לפני תחילת הניתוח.
הערה: תנועה של כל חלק של העכבר היא אינדיקציה לכך שהעכבר אינו מורדם לחלוטין. יש לתת מיד לבעל החיים חומר הרדמה נוסף על ידי הגדלת ריכוז חומר ההרדמה.
- כסו את עיני העכבר בכמות קטנה של ג'ל עיניים כדי למנוע יובש בעיניים.
- הליך כירורגי
- ספוג את אזור הניתוח 3 פעמים עם chlorhexidine אלכוהול. בעזרת מלקחיים וזוג מספריים, בצעו חתך ישר בקוטר 1 ס"מ לאורך הצד הגבי, במרחק של 3 מ"מ מהגידול (איור 2A, 2B).
הערה: סטנדרטיזציה של החתך ל-1 ס"מ בכל עכבר (באמצעות סרגל) מאפשרת הערכה אחידה של ריפוי פצעים בין עכברים. איתור החתך במרחק של 3 מ"מ מהגידול מאפשר טיפול אדג'ובנטי תוך גידולי לאחר מכן ללא דליפה מהפצע.
- באמצעות פינצטה, למשוך משם את facia ואת רקמת שומן תת עורית בין הגידול לבין הצפק. הגידול התת עורי מחובר בדרך כלל לצד העור.
- פתחו את הפצע על-ידי החזקה עדינה של העור בצד הנושא את הגידול באמצעות פינצטה ו"הפכו" את הגידול כך שייראה החוצה (איור 2C, 2D).
הערה: החלק של הגידול להיות debulked צריך להיות הקרוב ביותר לפתח יש מספיק עור כדי לסגור את הפצע. היזהר לא לחתוך את העור בעת הסרת הגידול.
- בעזרת זוג מספריים, חותכים את קפסולת הגידול לשניים כדי להסיר אותה, החל מבסיס הגידול הקרוב ביותר לפתח.
- עבור ניתוח debulk 50%, לחתוך באמצע הגידול. באמצעות מלקחיים מעוקלים, לגרוף את החלק של הגידול כדי להסיר (50%); גרפו את כל השאריות מהאזור המפורק.
- עבור 75% debulk, לבצע 50% debulk הגידול כמו בחלק 2.3.5 לעיל. לאחר מכן חותכים במחצית את 50% הנותרים של הגידול וגורפים 25% מהגידול באמצעות מלקחיים מעוקלים כמתואר לעיל.
- סגירת אתר הניתוח
- הניחו את הגידול הנותר בחזרה מתחת לעור, ובעזרת מלקחיים, משכו את דשי העור זה לזה וסדרו את העור לאורך הפצע.
- החזיקו את העור יחד 5 מ"מ מקצה הפצע, והשתמשו בקליפסים כירורגיים כדי לסגור את הפצע, החל בצד הקרוב ביותר למלקחיים. יש למרוח קליפסים רבים ככל הנדרש כדי להבטיח שאף רקמה מתחתיה לא תיחשף. בדרך כלל, שלושה עד ארבעה קליפסים מוחלים עם רווחים של 2 מ"מ בין קליפס.
הערה: אם קליפים כלשהם אינם מוחלים היטב, הסר אותם באמצעות מסיר קליפים והחלף אותם בקליפים חדשים.
- התאוששות של עכברים
- אפשרו לעכברים להתאושש על ידי הכנסתם לתא החימום החם (37 מעלות צלזיוס).
- הניחו את כלוב העכבר על כרית החום. עקבו אחר העכברים בתא החימום עד שהם התאוששו מחומר ההרדמה (ערים והולכים) ואז החזירו את העכברים לכלוב. השאירו את הכלוב על כרית החום למשך 10 דקות נוספות, עד שהעכברים יהיו פעילים יותר.
- תנו לעכברים מזון רטוב ורך. יש לעקוב אחר העכברים שעה לאחר הניתוח לצורך החלמה ולוודא שהקליפסים נשארים במקומם. ודאו שהכלוב דולק למחצה / חצי מחוץ לכרית החום כדי לאפשר לבעלי החיים לווסת את הטמפרטורה בעצמם ללא השגחה.
- מינון עכברים עם 0.1 מ"ג / ק"ג buprenorphine (100 μL תת עורית ב scruff של הצוואר) 6-8 שעות לאחר הניתוח (בסוף היום). עקוב אחר עכברים מוקדם בבוקר שלמחרת ומנה עכברים שוב עם 0.1 מ"ג / ק"ג buprenorphine (100 μL תת עורית בשפשוף הצוואר). תנו יותר אוכל רטוב לפי הצורך.
- עקוב אחר עכברים מדי יום במשך שבעת הימים הבאים. ניתן להסיר קליפים לאחר שבעה ימים באמצעות מסיר הקליפים.
- טיפול אדג'ובנטי או ניאו-אדג'ובנטי
- טפלו בעכברים באופן פרי-אופרטיבי עם (ניאו)טיפול אדג'ובנטי בכל זמן נתון, בהתאם לטיפול המעניין.
- לדוגמה, יש לטפל בעכברים במנה אחת של 100 מיקרוגרם של אנטי-CTLA-4 תוך צפקית ביום ה-15 לאחר החיסון או בשלוש מנות של 200 מיקרוגרם אנטי-PD-1 i.p. ביום ה-15, ה-17 וה-19 לאחר החיסון.
