טכניקה להשתלת עור אנושי במודל עכבר

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. עיבוד דגימת עור אנושית מתורם

הערה: דגימת העור האנושית ששימשה בהשתלה זו הייתה דגימה גדולה שנאספה מבטנו של חולה בריא. הדגימה חייבת להיות לפחות 15 ס"מ x 7.5 ס"מ. מגבלות גודל עשויות להשפיע על מספר העכברים שהעור זמין עבורם ועל בחירת גודל השתל.

1. יש לשמור את דגימת העור בטמפרטורות קרות (על קרח; 4°C) לפני הכנה והשתלה. שמור את הדגימה לחה בכוס איסוף דגימה סגורה עם הגזה ספוגה במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
   הערה: לא מומלץ לאחסן את דגימת העור בטמפרטורה של 4°C למשך יותר מיומיים. עם זאת, קיימים דיווחים שבהם דגימות העור מאוחסנות למשך זמן רב יותר.
   זהירות: טפל בכל הרקמה האנושית באמצעי זהירות סטנדרטיים נגד סיכונים ביולוגיים.
2. היכונו לדרמטומה של דגימת העור האנושי במכסה מנוע מעוקר של רקמת לחץ שלילי על לוח דיסקציה מעוקר.
3. הניחו את דגימת העור, צד האפידרמיס כלפי מעלה, על לוח הנתיחה. נגבו את האפידרמיס עם פד סטרילי להכנת אלכוהול ולאחר מכן עם PBS.
4. הצמד את הקצה הקרוב יותר של העור למקומו באמצעות סיכת T מנתחת בגודל 1.5 אינץ' (ראה טבלת חומרים).
5. יש לבצע דרמטום של דגימת העור בעובי של 400 מיקרומטר, תוך הפעלת לחץ יציב תוך חיתוך קדימה בזווית של 30°-45°. בצע את כל ההוראות ואמצעי הבטיחות הספציפיים למכשירים (ראה טבלת חומרים).
   הערה: לפרטים על טכניקת הדרמטום, עיין בדו"ח שפורסם בעבר.
6. הכינו צלחת פטרי בגודל 100 מ"מ על 20 מ"מ על ידי הנחת גזה סטרילית ספוגה ב-PBS סטרילי בתחתית המנה. מניחים את העור, צד האפידרמיס כלפי מעלה, על הגזה הרטובה.
7. אטמו וכסו את קצוות הלוח בסרט איטום שקוף למחצה (ראו טבלת חומרים) כדי לוודא שהדגימה אינה מזוהמת. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של 4°C לפני ההשתלה.

2. התניה והכנה לפני ניתוח

1. הכינו את המכשירים הסטריליים ותחנת ניתוח סטרילית להשתלה. השתמש במגבות נייר אוטוקלאביות כמשטחים סטריליים למיקום מכשירים ועכברים.
   הערה: ניתן להשתיל עכברים לאחר הגמילה אך עדיף להשתיל אותם בין גיל 8-10 שבועות. עכברים משני המינים עשויים להיות מושתלים.
2. בצע את ההכנה הכירורגית, כגון הסרת שיער, באזור המופרד פיזית מתחנת הניתוח.
3. הכינו את האנטי-GR1 (ראו טבלת חומרים) על ידי דילול ל-1 מ"ג/מ"ל במי מלח סטריליים. יש לתת לכל עכבר מינון של 100 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר של תמיסת האנטי-GR1 תוך צפקית לאחר השראת הרדמה.
4. להרדים את העכברים, אחד בכל פעם, עם איזופלורן או חומרי הרדמה אחרים שאושרו על ידי מוסדי.
   הערה: איזופלורן צריך להינתן בריכוז של 3%-5% במהלך הזירוז. ברגע שהעכבר אינו נייד, יש להוריד את ריכוז האיזופלורן ל-1%-3% כדי להשפיע על משך הניתוח.
   1. עקוב אחר העכבר לעומק הרדמה מתאים על ידי התבוננות בקצב הנשימה, היעדר תגובת צביטת בוהן וצבע ורוד מתאים של האוזניים והפה.
      זהירות: השתמש במכונות הרדמה מתאימות ובשיטות נבלות, והימנע מחשיפה לאדי איזופלורן.
5. העבר את העכבר לכרית חימום או למקור חום אחר (ראה טבלת חומרים).
6. לנהל את משחת העיניים על ידי טבילה טיפה קטנה של משחה על העין עם אצבע כפפה.
7. מתן משככי כאבים בופרנורפין (0.08 מ"ג/ק"ג) וקרפרופן (5 מ"ג/ק"ג) (ראה טבלת חומרים) תת עורית על ידי צביטת העור והזרקה בזווית מקבילה לגוף.
   הערה: הכינו את משככי הכאבים לפני הטיפול בהתאם לפרוטוקולים מוסדיים. בצע הנחיות מוסדיות לבחירה וניהול של משככי כאבים. שיטת שיכוך הכאבים שבה נעשה שימוש במחקר זה מתוארת בשלב 2.7 ובאיור 1.
8. יש לתת את האנטי-GR1 (מוכן בשלב 2.4) תוך צפקית על ידי הרמה קלה של העכבר בזנב, חשיפת הבטן והזרקה בזווית של 30° באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל (12.7 מ"מ).
9. השתמש בקוצץ חשמלי בטוח לבעלי חיים (ראה טבלת חומרים) כדי לגלח את החלק האמצעי והעליון של הצד הגבי של העכבר.
10. נקו את כל השיער ומרחו כמות נדיבה של משחה להסרת שיער על העור המגולח למשך 30 שניות עד דקה.
11. נגבו לחלוטין את המשחה להסרת שיער בעזרת מגבת נייר ו-PBS.

3. הליך ההשתלה

1. העבר את העכבר למקום כירורגי משני, הרחק מתחנת הסרת השיער.
2. לעקר את אתר הניתוח עם מקל יוד בתנועה סיבובית, מתחיל באמצע ומתאמן לכיוון קצה האזור depilated.
3. מניחים חתיכת ניילון נצמד סטרילי מעל העכבר וחותכים חלון בניילון מעט גדול יותר מגודל השטח להשתלה.
4. חתכו חלק בצורת מלבן בגודל 10 מ"מ x 10 מ"מ של עור התורם להשתלה באזמל. עשו זאת על ידי החזקת העור התורם במקומו עם החלק האחורי של המלקחיים וחיתוך לצד המלקחיים עם האזמל.
5. בעזרת המספריים הכירורגיים, חותכים אזור מלבני של עור עכבר התואם את גודל פיסת העור התורמת, ויוצרים מיטת שתל. השתמש במלקחיים כדי למשוך את העור הרחק מהגוף, וגזור את העור עם מספריים בזווית הרחק מהגוף כדי למנוע חיתוך עמוק לתוך facia.
6. הניחו את פיסת העור של התורם, צד האפידרמיס כלפי מעלה, על מיטת השתל המוכנה.
7. באמצעות החלק האחורי של המלקחיים, לתפעל את העור, להחליק קדימה ואחורה עד העור התורם שוכב שטוח לחלוטין על מיטת השתל
.
8. יש להוסיף טיפות של דבק רקמת דבק כירורגי (ראו טבלת חומרים) במקום בו העור התורם פוגש את עור העכבר והחזיקו את העכבר ואת עור התורם יחד עם מלקחיים למשך 1-2 שניות כך שהדבק נדבק לרקמות. אטמו לחלוטין את קצה השתל ואפשרו לדבק להתייבש באופן מלא.
9. חבשו את העכברים (איור 2) לפי השלבים הבאים.
   1. חתכו חתיכת גזה פטרולאטומית (ראו טבלת חומרים) גדולה מספיק כדי לכסות את שטח השתל לחלוטין.
   2. מכסים את השתל עם גזה פטרולאטום ולחץ קלות את הגזה על העור באמצעות מלקחיים.
   3. חותכים רצועה של סרט שקוף לאורך, כך שהרוחב יהיה גדול מספיק כדי לכסות את פצע העכבר.
   4. לחץ בחוזקה על הלבשת הסרט השקוף, בצד הדבק כלפי מטה, מעל הגזה. גלגלו במהירות את העכבר כדי לעטוף את החבישה לחלוטין סביב פלג הגוף העליון, וודאו שהיא מתאימה היטב מבלי להפריע לנשימה, וכל הגפיים חופשיות לתנועה.
   5. הכניסו את העכבר לכלוב התאוששות ועקבו אחריו עד שהוא ערני וזז. ספק מקור חום בחלק מהכלוב למשך 15 דקות לפחות לאחר ההתאוששות.
      הערה: בעלי החיים צפויים להתאושש תוך 1-5 דקות לאחר הכנסתם לכלוב ההתאוששות.

איור 1: ציר הזמן של הפרוטוקול שאומץ עבור מחקר xenograft.

תרשים 2: שיטה לחבישת עכבר לאחר ניתוח. העכבר עטוף היטב בגזה פטרולאטומית ובהלבשת סרט שקוף בזמן ההרדמה. (A) גזה פטרולטום ממוקמת על שטח מעט גדול יותר מהפצע הניתוחי. (B) מכינים את הלבשת הסרט השקוף: רצועה ארוכה נחתכת מעט רחבה יותר מגזה פטרולאטום. הגב המכסה את הצד הדביק של הלבשת הסרט השקוף מוסר חלקית. (C) הצד המודבק של סרט הצילום נלחץ בחוזקה כנגד גב העכבר, ומשאיר סנטימטר של מקום בקצה הקדמי של סרט הצילום. (D) העכבר מופעל על גבו. החלק הקדמי התלוי של הסרט נלחץ על העכבר, והגב מוסר. (E) העכבר עטוף היטב בסרט הצילום, והתמיכה הנותרת מוסרת כשהעכבר עוטף. (F) העכבר נעטף בהצלחה בחבישה, וזרועותיו ורגליו אינן מוגבלות.