טכניקה להשתלת עור אנושי במודל עכבר

תקציר

מקור: Moss, M. I. et al., Xenograft Skin Model כדי לתפעל את תגובות החיסון האנושיות ב-Vivo.J. Vis. Exp. (2022)

סרטון זה מדגים שיטה להשתלת עור אנושי על עכבר מדוכא חיסון עם תגובת נויטרופילים מדוכאת. השיטה כוללת מריחת עור אנושי בעובי מפוצל על מיטת השתל של העכבר, אטימתו וכיסויו להתאוששות. בסופו של דבר, העור האנושי נצמד לעור העכבר, מבסס את כלי הדם ואת זרימת הדם, וכתוצאה מכך קסנוגרפט עור מוצלח.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. עיבוד דגימת עור אנושית מתורם

הערה: דגימת העור האנושית ששימשה בהשתלה זו הייתה דגימה גדולה שנאספה מבטנו של חולה בריא. הדגימה חייבת להיות לפחות 15 ס"מ x 7.5 ס"מ. מגבלות גודל עשויות להשפיע על מספר העכברים שהעור זמין עבורם ועל בחירת גודל השתל.

1. יש לשמור את דגימת העור בטמפרטורות קרות (על קרח; 4°C) לפני הכנה והשתלה. שמור את הדגימה לחה בכוס איסוף דגימה סגורה עם הגזה ספוגה במי מלח חוצצים פוספט (PBS).
   הערה: לא מומלץ לאחסן את דגימת העור בטמפרטורה של 4°C למשך יותר מיומיים. עם זאת, קיימים דיווחים שבהם דגימות העור מאוחסנות למשך זמן רב יותר.
   זהירות: טפל בכל הרקמה האנושית באמצעי זהירות סטנדרטיים נגד סיכונים ביולוגיים.
2. היכונו לדרמטומה של דגימת העור האנושי במכסה מנוע מעוקר של רקמת לחץ שלילי על לוח דיסקציה מעוקר.
3. הניחו את דגימת העור, צד האפידרמיס כלפי מעלה, על לוח הנתיחה. נגבו את האפידרמיס עם פד סטרילי להכנת אלכוהול ולאחר מכן עם PBS.
4. הצמד את הקצה הקרוב יותר של העור למקומו באמצעות סיכת T מנתחת בגודל 1.5 אינץ' (ראה טבלת חומרים).
5. יש לבצע דרמטום של דגימת העור בעובי של 400 מיקרומטר, תוך הפעלת לחץ יציב תוך חיתוך קדימה בזווית של 30°-45°. בצע את כל ההוראות ואמצעי הבטיחות הספציפיים למכשירים (ראה טבלת חומרים).
   הערה: לפרטים על טכניקת הדרמטום, עיין בדו"ח שפורסם בעבר.
6. הכינו צלחת פטרי בגודל 100 מ"מ על 20 מ"מ על ידי הנחת גזה סטרילית ספוגה ב-PBS סטרילי בתחתית המנה. מניחים את העור, צד האפידרמיס כלפי מעלה, על הגזה הרטובה.
7. אטמו וכסו את קצוות הלוח בסרט איטום שקוף למחצה (ראו טבלת חומרים) כדי לוודא שהדגימה אינה מזוהמת. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של 4°C לפני ההשתלה.

2. התניה והכנה לפני ניתוח

1. הכינו את המכשירים הסטריליים ותחנת ניתוח סטרילית להשתלה. השתמש במגבות נייר אוטוקלאביות כמשטחים סטריליים למיקום מכשירים ועכברים.
   הערה: ניתן להשתיל עכברים לאחר הגמילה אך עדיף להשתיל אותם בין גיל 8-10 שבועות. עכברים משני המינים עשויים להיות מושתלים.
2. בצע את ההכנה הכירורגית, כגון הסרת שיער, באזור המופרד פיזית מתחנת הניתוח.
3. הכינו את האנטי-GR1 (ראו טבלת חומרים) על ידי דילול ל-1 מ"ג/מ"ל במי מלח סטריליים. יש לתת לכל עכבר מינון של 100 מיקרוגרם/100 מיקרוליטר של תמיסת האנטי-GR1 תוך צפקית לאחר השראת הרדמה.
4. להרדים את העכברים, אחד בכל פעם, עם איזופלורן או חומרי הרדמה אחרים שאושרו על ידי מוסדי.
   הערה: איזופלורן צריך להינתן בריכוז של 3%-5% במהלך הזירוז. ברגע שהעכבר אינו נייד, יש להוריד את ריכוז האיזופלורן ל-1%-3% כדי להשפיע על משך הניתוח.
   1. עקוב אחר העכבר לעומק הרדמה מתאים על ידי התבוננות בקצב הנשימה, היעדר תגובת צביטת בוהן וצבע ורוד מתאים של האוזניים והפה.
      זהירות: השתמש במכונות הרדמה מתאימות ובשיטות נבלות, והימנע מחשיפה לאדי איזופלורן.
5. העבר את העכבר לכרית חימום או למקור חום אחר (ראה טבלת חומרים).
6. לנהל את משחת העיניים על ידי טבילה טיפה קטנה של משחה על העין עם אצבע כפפה.
7. מתן משככי כאבים בופרנורפין (0.08 מ"ג/ק"ג) וקרפרופן (5 מ"ג/ק"ג) (ראה טבלת חומרים) תת עורית על ידי צביטת העור והזרקה בזווית מקבילה לגוף.
   הערה: הכינו את משככי הכאבים לפני הטיפול בהתאם לפרוטוקולים מוסדיים. בצע הנחיות מוסדיות לבחירה וניהול של משככי כאבים. שיטת שיכוך הכאבים שבה נעשה שימוש במחקר זה מתוארת בשלב 2.7 ובאיור 1.
8. יש לתת את האנטי-GR1 (מוכן בשלב 2.4) תוך צפקית על ידי הרמה קלה של העכבר בזנב, חשיפת הבטן והזרקה בזווית של 30° באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל (12.7 מ"מ).
9. השתמש בקוצץ חשמלי בטוח לבעלי חיים (ראה טבלת חומרים) כדי לגלח את החלק האמצעי והעליון של הצד הגבי של העכבר.
10. נקו את כל השיער ומרחו כמות נדיבה של משחה להסרת שיער על העור המגולח למשך 30 שניות עד דקה.
11. נגבו לחלוטין את המשחה להסרת שיער בעזרת מגבת נייר ו-PBS.

3. הליך ההשתלה

1. העבר את העכבר למקום כירורגי משני, הרחק מתחנת הסרת השיער.
2. לעקר את אתר הניתוח עם מקל יוד בתנועה סיבובית, מתחיל באמצע ומתאמן לכיוון קצה האזור depilated.
3. מניחים חתיכת ניילון נצמד סטרילי מעל העכבר וחותכים חלון בניילון מעט גדול יותר מגודל השטח להשתלה.
4. חתכו חלק בצורת מלבן בגודל 10 מ"מ x 10 מ"מ של עור התורם להשתלה באזמל. עשו זאת על ידי החזקת העור התורם במקומו עם החלק האחורי של המלקחיים וחיתוך לצד המלקחיים עם האזמל.
5. בעזרת המספריים הכירורגיים, חותכים אזור מלבני של עור עכבר התואם את גודל פיסת העור התורמת, ויוצרים מיטת שתל. השתמש במלקחיים כדי למשוך את העור הרחק מהגוף, וגזור את העור עם מספריים בזווית הרחק מהגוף כדי למנוע חיתוך עמוק לתוך facia.
6. הניחו את פיסת העור של התורם, צד האפידרמיס כלפי מעלה, על מיטת השתל המוכנה.
7. באמצעות החלק האחורי של המלקחיים, לתפעל את העור, להחליק קדימה ואחורה עד העור התורם שוכב שטוח לחלוטין על מיטת השתל
.
8. יש להוסיף טיפות של דבק רקמת דבק כירורגי (ראו טבלת חומרים) במקום בו העור התורם פוגש את עור העכבר והחזיקו את העכבר ואת עור התורם יחד עם מלקחיים למשך 1-2 שניות כך שהדבק נדבק לרקמות. אטמו לחלוטין את קצה השתל ואפשרו לדבק להתייבש באופן מלא.
9. חבשו את העכברים (איור 2) לפי השלבים הבאים.
   1. חתכו חתיכת גזה פטרולאטומית (ראו טבלת חומרים) גדולה מספיק כדי לכסות את שטח השתל לחלוטין.
   2. מכסים את השתל עם גזה פטרולאטום ולחץ קלות את הגזה על העור באמצעות מלקחיים.
   3. חותכים רצועה של סרט שקוף לאורך, כך שהרוחב יהיה גדול מספיק כדי לכסות את פצע העכבר.
   4. לחץ בחוזקה על הלבשת הסרט השקוף, בצד הדבק כלפי מטה, מעל הגזה. גלגלו במהירות את העכבר כדי לעטוף את החבישה לחלוטין סביב פלג הגוף העליון, וודאו שהיא מתאימה היטב מבלי להפריע לנשימה, וכל הגפיים חופשיות לתנועה.
   5. הכניסו את העכבר לכלוב התאוששות ועקבו אחריו עד שהוא ערני וזז. ספק מקור חום בחלק מהכלוב למשך 15 דקות לפחות לאחר ההתאוששות.
      הערה: בעלי החיים צפויים להתאושש תוך 1-5 דקות לאחר הכנסתם לכלוב ההתאוששות.

תוצאות

איור 1: ציר הזמן של הפרוטוקול שאומץ עבור מחקר xenograft.

תרשים 2: שיטה לחבישת עכבר לאחר ניתוח. העכבר עטוף היטב בגזה פטרולאטומית ובהלבשת סרט שקוף בזמן ההרדמה. (A) גזה פטרולטום ממוקמת על שטח מעט גדול יותר מהפצע הניתוחי. (B) מכינים את הלבשת הסרט השקוף: רצ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10% פורמלין חוצץ ניטרלי	פישר	SF100-20	קיבוע להיסטולוגיה
דבק רקמות Vetbond 3M	3 דקות	1469SB	דבק כירורגי
שיבוט אנטי-GR1 RB6-8C5	BioXcell	BE0075	אנטי דחייה
שקיות Autoclave	VWR	89140-800	עבור autoclaving כלים ומגבות נייר
Buprenex 0.3 מ"ג/מ"ל	קובטרוס	59122	שיכוך כאבים
קרפרופן 50 מ"ג/מ"ל	זואטיס	NADA # 141-199	שיכוך כאבים
D42 להב דרמטומי	הומקה	5.D42BL10	דרמטום (להב אחד לדגימה)
דרמטום D42	הומקה	4.ד42	דרמטום
אזמל חד פעמי	בארד-פרקר	371610	הכנת העור
חיתוך פיני T; 1-1/2 אינץ', 1000/CS 1.5	קול-פרמר	UX-10915-03	כדי להצמיד דגימת עור לדרמטום
מספריים לדיסקציה	מדיקון	02.04.10	הכנת דוגמאות ונתיחת עכבר
DNAse	סיגמא-אולדריץ'	DN25-1G	עיכול העור
קוצצים חשמליים	קנט	CL8787-KIT	הסרת שיער
מלקחיים	מדיקון	07.60.07	הכנת דוגמאות ונתיחת עכבר
גזה	פישרברנד	22-362-178	הכנת דוגמאות
מנורת חימום	מורגנוויל סיינטיפיק	HL0100	טיפול לאחר ניתוח
רפידות חימום בגודל 4 אינץ' על 10 אינץ'	פריסטק	20415	אספקת חום כירורגית
אינסולין 1cc מזרקים 12.7 מ"מ	ב.ד.	329410	מינהל התרופות
איזופלורן	הפרמקופיאה של ארצות הברית (USP)	נד"ק 66794-013-25	הרדמה
מכונת איזופלורן	VetEquip	911103	הרדמה
נאיר לגברים	נאיר	10022600588556	הסרת שיער
Neomycin ו Polymyxin Bisulfates ו Bacitracin אבץ משחה אופתלמית	Dechra	NDC 17478-235-35	משחת עיניים למניעת ייבוש
הנהון. עכברי Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)	מעבדת ג'קסון	5557	עכברים
מגבות נייר	קלינקס	100848	עשוי להיות autoclaved עבור משטחים סטריליים
פארפילם	פישר סיינטיפיק	13-374-12	סרט איטום שקוף למחצה
צלחת פטרי 150 מ"מ	קורנינג	430597	אחסון לדוגמה
ניילון נצמד	פישרברנד	22-305-654	הכנת האתר
מקל ספוגית פרובידון-יוד	PDI	S41350	עיקור אתרים
הזנה רכה ולחות אוראלית (נקטר נאפה)	Se Lab קבוצת Inc	NC9066511	להשלמת עכברים שהחלימו בצורה גרועה לאחר ניתוח
גביעי אוסף דגימות	פישר סיינטיפיק	22-150-266	אחסון לדוגמה
פד הכנה סטרילי לאלכוהול	פישרברנד	22-363-750	הכנת העור
PBS סטרילי	גיבקו	14190-144	מדיה לאחסון לדוגמה
מי מלח סטריליים	הוספירה	נד"ק 0409-4888-02	לדילול תרופות
סרט טגדרם 4 אינץ' x 43/4 אינץ'	3 דקות	1626	חבישת פצע סרט שקופה
וזלין פטרולאטום גזה 3" x 8"	קנדל	414600	חבישת פצעים