טכניקה ליצירת מודל עכבר קסנוגרפט אנושי המושתל על ידי PBMC אנושי

תקציר

מקור: Li, Z., et al. A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים בדיקה ליצירת מודל עכבר xenograft אנושי. עכבר מדוכא חיסון מוזרק עם cyclophosphamide כדי לגרום לדלדול תאי החיסון. תאי גידול שמקורם במטופל מעורבבים עם תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) בהידרוג'ל מוזרקים תת עורית לעכבר, ויוצרים גידול עם תאי T חודרים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון. כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הקמת מודל אנושי מבוסס PBMC

1. מיאלואבלציה של עכברי NOD/SCID באמצעות ציקלופוספמיד: קביעת מינונים אופטימליים
   1. רכשו נקבות עכברי סוכרת/כשל חיסוני משולב חמור (NOD/SCID) (6-8 שבועות).
      הערה: כל העכברים שהשתתפו במחקר זה היו נקבות.
   2. הכינו ציקלופוספמיד (CP) במינונים שונים (50, 100 ו-150 מ"ג/ק"ג) במי מלח. הכינו דיסולפירם (DS) ב-0.8% טווין-80 במי מלח במינון של 125 מ"ג/ק"ג.<בר/> הערה: ריכוזים שונים של CP הוכנו כדי לאפשר מתן כמויות שוות של תמיסת תרופות לעכברים שקיבלו מינונים שונים של CP.
   3. טפל בבעלי החיים עם CP (intraperitoneal, i.p.) ו- DS (peroral, p.o.) פעם ביום במשך יומיים. תן DS (p.o.) שעתיים לאחר כל מנה של CP.
      הערה: DS מפחית את האורוטוקסיות של CP בעכברים, ו-CP בשילוב עם DS הוצע כבעל נויטרופניה ארוכת טווח יותר מאשר בעלי חיים שטופלו ב-CP בלבד. ייתכן שיהיה צורך לקבוע מראש את משטר המינון של CP לפני מחקרים בפועל, ונמצא שהוא משתנה מעט בין זני עכברים שונים עם כשל חיסוני.
   4. לאסוף דגימות דם מן הסינוס ורידי המסלול ולהעביר אשלגן ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA-K) צינוריות מצופות על קרח ביום 0 (1 שעה לפני המנה הראשונה), יום 2 (24 שעות לאחר מנה 2) ויום 4 (72 שעות לאחר מנה 2).
   5. לבחון את אפקט המיאלואבלציה לאחר טיפול CP ו- DS על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS). השתמש CD11b נגד עכבר חולדה (M1/70), חולדה נגד עכבר Ly6C (HK1.4) וחולדה נגד עכבר Ly6G (1A8) עבור gating CD11b ⁺ Ly6C^גבוה כמו נויטרופילים, CD11b ⁺ Ly6C^גבוה כמו מונוציטים.
   6. רשום את משקל הגוף ואת מצבם הבריאותי של העכברים מדי יום במשך שבוע אחד. המינון האופטימלי של CP ו- DS נקבע כמשטר שמביא לדלדול מרבי של נויטרופילים ומונוציטים מבלי לגרום רעילות חמורה לעכברים.
2. השתלת PBMC אנושית והשתלת גידולים: הגדרת מודל
   1. בודד PBMCs אנושיים מתורמים בריאים על ידי צנטריפוגה הדרגתית צפיפות בהתאם להוראות היצרן.
   2. יש לטפל מראש בעכברים עם CP ו-DS כפי שמצוין בשלבים 1.1.2 ו-1.1.3 כדי להגביר את יעילות ההשתלה.
   3. 20 עד 24 שעות לאחר המנה השנייה של CP ו- DS, הזריקו קו תאי גידול אנושיים כגון תאי A431 (ATCC, 2.5 x 10⁶) ו- 5 x 10⁶ PBMCs מבודדים (מעורבבים בסך הכל 200 μL מלוחים חוצצי פוספט (PBS) המכילים 50% מטריג'ל), או שברי גידול (3 x 3 x 3 מ"מ³, בנפח כולל של 200 μL PBS המכיל 50% מטריג'ל) ו-200 μL של 5 x 10⁶ PBMCs (100 μL כל אחד בצד שמאל וימין של שבר גידול מושרש) תת עורית (s.c.) באגף הימני של בעלי החיים.
   4. למדוד את נפח הגידול הראשוני ולתעד פעמיים בשבוע במשך 4-6 שבועות.
      הערה: העכברים יעברו המתת חסד ברגע שמשקל גופם יאבד מעל 20% או שנפח הגידול שלהם יגיע ל-2,000 מ"מ³ או שהגידול יהיה כיב.
   5. הרדימו את העכברים בתאי גזים עם פחמן דו חמצני. לאסוף את כל רקמות הגידול בעכברים שהוקרבו עם מספריים אופתלמיים ולעבד אותם לניתוח היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה (IHC). בחן את ביטויי CD8, PD-1 ו- PD-L1 האנושיים ברקמות אלה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
הפרדת PBMC / תרבית תאים
היסטופק-1077	סיגמא	10771	בידוד תאים
DMEM	קורנינג	10-013-CVR	תרבית תאים
DPBS	קורנינג	21-031-CVR	תרבית תאים
פ.ב.ס.	קורנינג	35-076-CV	תרבית תאים
פניצילין-סטרפטומיצין, נוזלי	גיבקו	15140-163	תרבית תאים
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום	גיבקו	25200-114	תרבית תאים
מטריג'ל	קורנינג	356237	חיסון CDX
ניתוח FACS
Deoxyribonuclease I מלבלב בקר	סיגמא	ד.נ.25	הכנת דוגמאות
קולגנאז סוג I	סיגמא	C0130	הכנת דוגמאות
נוגדן CD11b נגד עכבר/אדם (M1/70)	ביולג'נד	101206	FACS
נוגדן Ly-6C נגד עכבר (HK1.4)	ביולג'נד	128008	FACS
נוגדן נגד עכבר Ly-6G (1A8)	ביולג'נד	127614	FACS
נוגדן CD8 אנטי-אנושי (OKT8)	Sungene ביוטק	H10082-11H	FACS
נוגדן CD279 (MIH4) אנטי-אנושי	eBioscience	12-9969-42	FACS
נוגדן CD3 אנטי-אנושי (HIT3a)	4A ביוטק	--	FACS
גויאבה easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer	מיליפור	0500-4008	FACS
השתלת גידול/PDX / מינון / מדידה
ציקלופוספמיד	י&ק	חתול#419656, CAS#6055-19-2	יעילות In vivo
דיסולפיראם	י&ק	חתול#591123, CAS#97-77-8	יעילות In vivo
מזרק	ב.ד.	300841	חיסון CDX
מחטים היפודרמיות (14G)	שנגחאי SA Mediciall & פלסטיק מכשירים ושות', בע מ	0.7*32 TW SB	חיסון PDX
ורנייה קליפר (MarCal)	אנונימי	16ER	מדידת הגידול
כלובים מאווררים נפרדים IVC	Lingyunboji בע מ	IVC-128	מתקן לבעלי חיים