הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

עיכוב מבוסס siRNA של אוטופגיה בתאים דנדריטיים לא בוגרים נגועים בנגיף הרפס סימפלקס

777 צפיות

⸱

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

מקור: Düthorn, A., et al. siRNA אלקטרופורציה לווסת אוטופגיה בתאים דנדריטיים נגועים בנגיף הרפס סימפלקס מסוג 1. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים טכניקה קטנה המבוססת על RNA מפריע (siRNA) כדי להפריע לשטף אוטופגי. siRNA המכוון ל-FIP200 mRNA מוכנס לתאים דנדריטיים לא בוגרים (iDCs) שמקורם במונוציטים באמצעות אלקטרופורציה, גורם להפלה של ביטוי FIP200 ומוביל לעיכוב של שיבוש למין גרעיני באמצעות אוטופגיה. עם הוספת וירוס הרפס סימפלקס (HSV), היציאה הגרעינית של צאצאים נגיפיים מעוכבת בשל היעדר הפרעה למין באמצעות שטף אוטופגי.

פרוטוקול

DCs שמקורם במונוציטים נוצרו ממוצרי leukapheresis של תורמים בריאים. לשם כך התקבלה הצבעה חיובית מוועדת האתיקה המקומית (מספר אסמכתא 4556). הניסויים במחקר הנוכחי בוצעו בהתאם להמלצות ועדת האתיקה של "Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg" (אסמכתא מספר 4556). כל התורמים אישרו הסכמה מדעת בכתב, כולל בהתאם להצהרת הלסינקי.

1. יצירה וטיפול בתאים דנדריטיים לא בשלים (iDCs) ובתאים דנדריטיים בוגרים (mDCs)

  1. בודד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) מתאי מערכת לויקו-רדוקציה (LRSCs) כפי שתואר קודם לכן. הימנע משימור בהקפאה של PBMCs והשתמש בהם ישירות עם הבידוד כדי להשיג תפוקות DC גבוהות יותר.
  2. צור DCs אנושי....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
יחידת ליבה 4D-Nucleofector (מנגנון אלקטרופורציה II)Lonza (בזל, שוויץ)AAF-1002B
AB-סרוםSigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, גרמניה)H4522טיפוח תאים דנדריטיים
ACD-ASigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, גרמניה)9007281
Amaxa P3 תא ראשוני 4D-Nucleofector X קיט L (מכשיר ערכת אלקטרופורציה II)Lonza (בזל, שוויץ)V4XP-3024
אמרשם ECL פריים מערב מגיב זיהוי כתמיםGE Healthcare (זולינגן, גרמניה)RPN2232זיהוי כתמים מערביים
אמוניום פרסולפט (APS)Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, גרמניה)A3678
נוגד עכבר-IgG (עכבר, רב-שבטי, HRP)איתות סלולרי (ליידן, הולנד)7076זיהוי כתם מערבי
נוגד ארנבת-IgG (עז, רב-שבטי, HRP)איתות סלולרי (ליידן, הולנד)7074זיהוי כתם מערבי
BD FACS Canto II ציטומטר זרימהBD Biosciences (היידלברג, גרמניה)338962
תא הדבקה Fastblot B44Biometra (Göttingen, גרמניה)846-015-100
CCR7 (עכבר, Pe-Cy7)BioLegend (נפל, גרמניה)557648ציטומטריית זרימה
דילול: 1:100
שיבוט: G043H7
CD11c (עכבר, Pe-Cy5)BD Biosciences (היידלברג, גרמניה)561692ציטומטריית זרימה
דילול: 1:100
שיבוט: B-ly6
CD14 (עכבר, PE)BD Biosciences (היידלברג, גרמניה)555398ציטומטריית זרימה
דילול: 1:100
שיבוט: M5E2
CD3 (עכבר, FITC)BD Biosciences (היידלברג, גרמניה)555332ציטומטריית זרימה
דילול: 1:100
שיבוט: UCHT1
CD80 (עכבר, V450)BD Biosciences (היידלברג, גרמניה)560442ציטומטריית זרימה
דילול: 1:100
שיבוט: L307.4
CD83 (עכבר, APC)eBioscience Thermo Fisher Scientific (לנגנסלבולד, גרמניה)17-0839-41ציטומטריית זרימה
דילול: 1:200
שיבוט: HB15e
CD86 (עכבר, PE)BD Biosciences (היידלברג, גרמניה)553692ציטומטריית זרימה
דילול: 1:100
דימות תאי EVOS FLSystem AMG/Life Technologies (קרלסבד, ארה"ב)AMF4300
FIP200 (ארנב)איתות סלולרי (ליידן, הולנד)12436זיהוי כתם מערבי
דילול: 1:1000
שיבוט: D10D11
מנגנון Gene Pulser II (מנגנון אלקטרופורציה I)BioRad Laboratories GmbH (מינכן, גרמניה)165-2112
GM-CSF (4x104 U/מ"ל)Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, גרמניה)130-093-868
HLA-DR (עכבר, APC-Cy7)BioLegend (נפל, גרמניה)307618ציטומטריית זרימה
דילול: 1:200
שיבוט: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43BioVexזיהום DC
IL-1β (0.1x106 U/מ"ל)Cell Genix GmbH (פרייבורג, גרמניה)1411-050
IL-4 (1x106 U/מ"ל)Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, גרמניה)130-093-924
IL-6 (1x106 U/מ"ל)Cell Genix GmbH (פרייבורג, גרמניה)1404-050
ImageQuant LAS 4000GE Healthcare (זולינגן, גרמניה)28955810
ל-גלוטמיןLonza (בזל, שוויץ)17-605E
LIVE/DEAD ערכת כתמים של תאים מתים סגולים הניתנים לתיקוןLife Technologies (קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב)L34964צביעת L/D בציטומטריית זרימה
לימפופרAlere Technologies AS (אוסלו, נורווגיה)04-03-9391/01
מגנזיום כלוריCarl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)A537.1
Megafuge 2.0 RSHeraeus (Hanau, גרמניה)75015505
תא הספירה של נויבאוארברנד (ורטהיים, גרמניה)717805
צלוחיות תרבית תאי Nunc (175.0 סמ"ר)Thermo Scientific (רוקפורד, ארה"ב)159910
פרפורמאלדהיד, 16Alfa Aesar, Haverhill, ארה"ב43368.9M
פרפקטספין 24 פלוסPeqlab (Erlangen, גרמניה)C2500-R-PL
PGE2 (1 מ"ג/מ"ל)פייזר (ברלין, גרמניה)BE130681
מלח חוצץ פוספט (PBS)Lonza (בזל, שוויץ)17-512F
RestoreTM מאגר הפשטת כתמים מערביThermo Scientific, רוקפורד, ארה"ב21059
פלטפורמת נדנדה wt 15Biometra (Göttingen, גרמניה)042-590
רוטיבלוקCarl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)A151.4
רוטי עומס 1 (4x)Carl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)K929.3
ג'ל רוטיפורזי 30 (37.5:1)Carl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)3029.1
RPMI 1640Lonza (בזל, שוויץ)12-167F
סודיום דודציל סולפט (SDS)Carl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)2326.2
נוחות תרמיקוסרEppendorf (המבורג, גרמניה)5355 000.011
TNF-α (10 מיקרוגרם/מ"ל)Peprotech (המבורג, גרמניה)300-01א
טריסCarl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)4855.3
תמיסה כחולה טריפאן (0.4Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, גרמניה)T8154
טווין 20Carl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)9127.1
Whatman 0.2 מיקרומטר קרום ניטרוצלולוזGE Healthcare (זולינגן, גרמניה)10600001
נייר כרומטוגרפיה WhatmanTM 3 מ"מ ChrFisher Scientific GmbH (Schwerte, גרמניה)3030917
% %)

גלה מאמרים נוספים

אלקטרופורציה של siRNAהשתקה של FIP200עיכוב אוטופגיהציטומטריית זרימהאנליזת Western Blotהערכת חיוניות תאיםזיהום ב-HSV-1פגיעה בלמינא גרעינית