עיכוב מבוסס siRNA של אוטופגיה בתאים דנדריטיים לא בוגרים נגועים בנגיף הרפס סימפלקס

תקציר

מקור: Düthorn, A., et al. siRNA אלקטרופורציה לווסת אוטופגיה בתאים דנדריטיים נגועים בנגיף הרפס סימפלקס מסוג 1. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים טכניקה קטנה המבוססת על RNA מפריע (siRNA) כדי להפריע לשטף אוטופגי. siRNA המכוון ל-FIP200 mRNA מוכנס לתאים דנדריטיים לא בוגרים (iDCs) שמקורם במונוציטים באמצעות אלקטרופורציה, גורם להפלה של ביטוי FIP200 ומוביל לעיכוב של שיבוש למין גרעיני באמצעות אוטופגיה. עם הוספת וירוס הרפס סימפלקס (HSV), היציאה הגרעינית של צאצאים נגיפיים מעוכבת בשל היעדר הפרעה למין באמצעות שטף אוטופגי.

פרוטוקול

DCs שמקורם במונוציטים נוצרו ממוצרי leukapheresis של תורמים בריאים. לשם כך התקבלה הצבעה חיובית מוועדת האתיקה המקומית (מספר אסמכתא 4556). הניסויים במחקר הנוכחי בוצעו בהתאם להמלצות ועדת האתיקה של "Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg" (אסמכתא מספר 4556). כל התורמים אישרו הסכמה מדעת בכתב, כולל בהתאם להצהרת הלסינקי.

1. יצירה וטיפול בתאים דנדריטיים לא בשלים (iDCs) ובתאים דנדריטיים בוגרים (mDCs)

1. בודד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) מתאי מערכת לויקו-רדוקציה (LRSCs) כפי שתואר קודם לכן. הימנע משימור בהקפאה של PBMCs והשתמש בהם ישירות עם הבידוד כדי להשיג תפוקות DC גבוהות יותר.
2. צור DCs אנושיים מ- PBMCs של תורמים בריאים שונים בצלוחיות תרבית תאי T175 כפי שתואר קודם לכן. בקצרה, יש להשתמש ב-350-400 מיליון PBMCs ב-30 מ"ל DC בינוני (RPMI 1640 ללא L-גלוטמין, 1% (v/v) סרום אנושי מסוג AB (AB-serum), 100 U/mL פניצילין, 100 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין, 0.4 mM L-גלוטמין, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)) לכל בקבוק תרבית תאים לבידוד מונוציטים על ידי היצמדות. לאחר שעה אחת, שטפו את המקטע שאינו נדבק באמצעות RPMI 1640. הוסף מדיום DC טרי בתוספת 800 U/mL גרנולוציטים-מקרופאגים גורם מגרה מושבה (GM-CSF) ו 250 U/mL אינטרלוקין-4 (IL-4), ודגור במשך 3 ימים.
   1. ביום השלישי לאחר ההיצמדות, יש להוסיף 5 מ"ל של מדיום DC טרי המכיל GM-CSF ו-IL-4 עם ריכוז סופי של 400 U/mL ו-250 U/mL לכל בקבוק תרבית תאים, בהתאמה, להתמיינות DC.
   2. כדי לקצור iDCs, שטפו בעדינות iDCs שנצמדים באופן רופף מתחתית בקבוק תרבית התאים, ביום הרביעי לאחר ההיצמדות. חזור על שלב זה פעמיים. ליצירת mDCs, יש להוסיף קוקטייל התבגרות המורכב באופן הבא: GM-CSF (ריכוז סופי: 40 U/mL), IL-4 (ריכוז סופי: 250 U/mL), אינטרלוקין-6 (IL-6, ריכוז סופי: 1000 U/mL), אינטרלוקין-1 בטא (IL-1β, ריכוז סופי: 200 U/mL), גורם נמק גידול אלפא (TNF-α, ריכוז סופי: 10 ng/mL), פרוסטגלנדין E2 (PGE2; ריכוז סופי: 1 מיקרוגרם/מ"ל).
   3. שישה ימים לאחר ההדבקה (יומיים לאחר השראת ההבשלה באמצעות קוקטייל ציטוקינים), שוטפים mDCs מתחתית בקבוק תרבית התא. חזור על שלב זה פעמיים.
      הערה: DCs לא בשלים ובשלים יכולים להיווצר ברצף מתורמים זהים בצלוחית תרבית תאים אחת. לשם כך, (i) להפריד את המספר המתאים של iDCs ו-(ii) לגרום להבשלה של התאים הנותרים בצלוחיות באמצעות קוקטייל הציטוקינים המפורט בשלב 1.2.2.
3. העבר iDCs או mDCs בתווך תרבית התאים המתאים לתוך צינורות 50 מ"ל. קצרו את התאים באמצעות צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
   1. השהה מחדש בעדינות (=שטיפה) DCs ב 5-10 מ"ל של RPMI 1640 לכל בקבוק תרבית תא. שלב את מתלי DC המתאימים בצינור אחד.
   2. הגדר את מספר התא באמצעות תא ספירה או שיטה חלופית. הימנע משינויי טמפרטורה בעת טיפול ב- iDCs, כדי להפחית את הסיכון לשינויים פנוטיפיים.

2. ניתוחים ציטומטריים של זרימה לניטור מצב ההתבגרות הפנוטיפית

1. העבר iDCs או mDCs (0.5 x 10,⁶) משלב 1.3.1 לצינור של 1.5 מ"ל. קצור את התאים באמצעות צנטריפוגה ב 3390 x גרם במשך 1.5 דקות. שטפו את התאים פעם אחת עם חיץ FACS (PBS בתוספת סרום עגל עוברי 2% (FCS)).
2. יש להשהות מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת נוגדנים (FACS buffer) המכילה נוגדנים ספציפיים המסומנים בתווית פלואורוכרום כנגד מולקולות פני שטח מוגדרות.
   1. השתמש בנוגדנים הבאים כדי לאמת טוהר (CD3- fluorescein isothiocyanate [FITC], CD14- phycoerythrin [PE]) כמו גם מצב התבגרות של DCs (CD80-PacBlue [כחול פסיפי]/-PE- ציאנין5 [Cy5], CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, CD86-PE, MHCII-APC-Cy7).
   2. הכינו דגימה אחת לא מוכתמת ב-100 μL של מאגר FACS כבקרה.
   3. הכתימו את התאים על קרח בחושך למשך 30 דקות.
3. לאחר מכן לשטוף את התאים פעמיים ב 1 מ"ל של חיץ FACS וצנטריפוגה ב 3390 x גרם במשך 1.5 דקות.
4. לבסוף, להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של מאגר FACS בתוספת 2% paraformaldehyde (PFA) ולנתח את התאים על ידי ציטומטריית זרימה. תאים קבועים ניתן לאחסן ב 4 ° C בחושך עד יומיים.

3. הפרעה של שטף אוטופגי המושרה על ידי HSV-1 באמצעות אלקטרופורציה של iDCs באמצעות FIP200-siRNA

הערה: הפרוטוקול הנוכחי לאלקטרופורציה siRNA שונה מ- Prechtel et al. (2007) ו- Gerer et al. (2017).

1. העבר iDCs (12 x 10⁶) ביום 3.5 לאחר ההיצמדות לתוך צינור 50 מ"ל. לאחר מכן, צנטריפוגות את התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant. במקביל, בצע ניתוח ציטומטרי של זרימה כדי לעקוב אחר מצב ההתבגרות כמתואר בשלב 2 (השתמש בסגול חיים/מת במקום CD80-PacBlue).
2. שטף בעדינות iDCs ב-5 מ"ל של OptiMEM ללא פנול אדום וצנטריפוגה את התאים במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות. השליך את הסופרנאטנט והשהה מחדש בעדינות iDCs ב-200 μL של OptiMEM ללא פנול אדום, תוך התאמת ריכוז תאים של 6 x 10⁶/100 μL. אין להניח את התאים על קרח ולהימנע משינויי טמפרטורה. המשך הלאה במהירות והימנע מתקופות דגירה ארוכות של iDCs ב-OptiMEM ללא פנול אדום.
3. העבר 75 pmol של siRNA ספציפי ל- FIP200 או 75 pmol של siRNA מקושקש, כבקרה, לקוביות אלקטרו 4 מ"מ והוסף 100 μL (6x10⁶ תאים) של תרחיף התא. פולס iDCs ישירות באמצעות מנגנון electroporation I, החלת ההגדרות הבאות: 500 V עבור 1 ms.
   1. לפני הליך הניסוי, להכין תרחיפים siRNA על פי הוראות היצרן, aliquot ולאחסן אותם ב -20 °C. להפשיר ולשמור אותם על קרח בעת שימוש אלה siRNA עבור electroporation. לפני אלקטרופורציה של הדגימות, בצע דופק בדיקה.
4. לאחר התחשמלות, יש להעביר ישירות את iDC ללוחות בעלי 6 בארות עם תווך DC טרי שחומם מראש (בתוספת 40 U/mL של GM-CSF ו-250 U/mL של IL-4). זרעו את התאים בריכוז סופי של 1 x 10⁶/mL והכניסו אותם לאינקובטור. אין לשטוף את התאים מתוך האלקטרו קובטה.
5. לאחר 48 שעות, יש לבחון תחילה את המורפולוגיה של iDCs מחושמלים באופן מיקרוסקופי. לאחר מכן, קצור את התאים באמצעות מגרד תאים ולהעביר אותם לתוך צינורות 15 מ"ל. שטפו את הבארות עם 1 מ"ל של PBS בתוספת 0.01% חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) והעבירו את התמיסה בצינורות המתאימים.
6. לאחר מכן, פצל 6 x 10⁶ iDCs לכל תנאי siRNA כמתואר בשלבים הבאים.
   1. השתמש ב- 0.5 x 10⁶ תאים כדי להעריך את מצב ההתבגרות ואת כדאיות התא כמתואר בשלב 2. השתמש בנוגדנים הבאים: CD11c-PE-Cy5, CCR7-PE-Cy7, CD83-APC, MHCII-APC-Cy7 וסגול חיים/מת.
   2. השתמש ב- 1 x 10⁶ תאים עבור ניתוחי כתמים מערביים כדי לאמת יעילות הפלה ספציפית ל- FIP200. העבר וקצור את התאים לתוך צינור Safelock 1.5 מ"ל על ידי צנטריפוגה ב 3390 x גרם במשך 1.5 דקות. הכינו ליזטים של תאים ובצעו ניתוחי כתמים מערביים.
   3. השתמש בתאים הנותרים (4.5 x 10,⁶) לניסויי זיהום HSV-1. עבור כל תנאי ניסוי, העבר 2.25 x 10⁶ iDCs לתוך 2 צינורות מ"ל והדביק אותם ב- HSV1 בריבוי זיהום (MOI) של 2 או הוסף מאגר MNT כבקרת דמה. בצע את הזיהום כמתואר.
   4. ב-20 שעות לאחר ההדבקה (hpi), קצרו את התאים באמצעות מגרד תאים והכינו ליזטים של תאים לניתוחי כתמים מערביים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
יחידת ליבה 4D-Nucleofector (מנגנון אלקטרופורציה II)	Lonza (בזל, שוויץ)	AAF-1002B
AB-סרום	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, גרמניה)	H4522	טיפוח תאים דנדריטיים
ACD-A	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, גרמניה)	9007281
Amaxa P3 תא ראשוני 4D-Nucleofector X קיט L (מכשיר ערכת אלקטרופורציה II)	Lonza (בזל, שוויץ)	V4XP-3024
אמרשם ECL פריים מערב מגיב זיהוי כתמים	GE Healthcare (זולינגן, גרמניה)	RPN2232	זיהוי כתמים מערביים
אמוניום פרסולפט (APS)	Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, גרמניה)	A3678
נוגד עכבר-IgG (עכבר, רב-שבטי, HRP)	איתות סלולרי (ליידן, הולנד)	7076	זיהוי כתם מערבי
נוגד ארנבת-IgG (עז, רב-שבטי, HRP)	איתות סלולרי (ליידן, הולנד)	7074	זיהוי כתם מערבי
BD FACS Canto II ציטומטר זרימה	BD Biosciences (היידלברג, גרמניה)	338962
תא הדבקה Fastblot B44	Biometra (Göttingen, גרמניה)	846-015-100
CCR7 (עכבר, Pe-Cy7)	BioLegend (נפל, גרמניה)	557648	ציטומטריית זרימה דילול: 1:100 שיבוט: G043H7
CD11c (עכבר, Pe-Cy5)	BD Biosciences (היידלברג, גרמניה)	561692	ציטומטריית זרימה דילול: 1:100 שיבוט: B-ly6
CD14 (עכבר, PE)	BD Biosciences (היידלברג, גרמניה)	555398	ציטומטריית זרימה דילול: 1:100 שיבוט: M5E2
CD3 (עכבר, FITC)	BD Biosciences (היידלברג, גרמניה)	555332	ציטומטריית זרימה דילול: 1:100 שיבוט: UCHT1
CD80 (עכבר, V450)	BD Biosciences (היידלברג, גרמניה)	560442	ציטומטריית זרימה דילול: 1:100 שיבוט: L307.4
CD83 (עכבר, APC)	eBioscience Thermo Fisher Scientific (לנגנסלבולד, גרמניה)	17-0839-41	ציטומטריית זרימה דילול: 1:200 שיבוט: HB15e
CD86 (עכבר, PE)	BD Biosciences (היידלברג, גרמניה)	553692	ציטומטריית זרימה דילול: 1:100
דימות תאי EVOS FL	System AMG/Life Technologies (קרלסבד, ארה"ב)	AMF4300
FIP200 (ארנב)	איתות סלולרי (ליידן, הולנד)	12436	זיהוי כתם מערבי דילול: 1:1000 שיבוט: D10D11
מנגנון Gene Pulser II (מנגנון אלקטרופורציה I)	BioRad Laboratories GmbH (מינכן, גרמניה)	165-2112
GM-CSF (4x104 U/מ"ל)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, גרמניה)	130-093-868
HLA-DR (עכבר, APC-Cy7)	BioLegend (נפל, גרמניה)	307618	ציטומטריית זרימה דילול: 1:200 שיבוט: L243
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43	BioVex		זיהום DC
IL-1β (0.1x106 U/מ"ל)	Cell Genix GmbH (פרייבורג, גרמניה)	1411-050
IL-4 (1x106 U/מ"ל)	Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, גרמניה)	130-093-924
IL-6 (1x106 U/מ"ל)	Cell Genix GmbH (פרייבורג, גרמניה)	1404-050
ImageQuant LAS 4000	GE Healthcare (זולינגן, גרמניה)	28955810
ל-גלוטמין	Lonza (בזל, שוויץ)	17-605E
LIVE/DEAD ערכת כתמים של תאים מתים סגולים הניתנים לתיקון	Life Technologies (קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב)	L34964	צביעת L/D בציטומטריית זרימה
לימפופר	Alere Technologies AS (אוסלו, נורווגיה)	04-03-9391/01
מגנזיום כלורי	Carl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)	A537.1
Megafuge 2.0 RS	Heraeus (Hanau, גרמניה)	75015505
תא הספירה של נויבאואר	ברנד (ורטהיים, גרמניה)	717805
צלוחיות תרבית תאי Nunc (175.0 סמ"ר)	Thermo Scientific (רוקפורד, ארה"ב)	159910
פרפורמאלדהיד, 16	Alfa Aesar, Haverhill, ארה"ב	43368.9M
פרפקטספין 24 פלוס	Peqlab (Erlangen, גרמניה)	C2500-R-PL
PGE2 (1 מ"ג/מ"ל)	פייזר (ברלין, גרמניה)	BE130681
מלח חוצץ פוספט (PBS)	Lonza (בזל, שוויץ)	17-512F
RestoreTM מאגר הפשטת כתמים מערבי	Thermo Scientific, רוקפורד, ארה"ב	21059
פלטפורמת נדנדה wt 15	Biometra (Göttingen, גרמניה)	042-590
רוטיבלוק	Carl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)	A151.4
רוטי עומס 1 (4x)	Carl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)	K929.3
ג'ל רוטיפורזי 30 (37.5:1)	Carl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)	3029.1
RPMI 1640	Lonza (בזל, שוויץ)	12-167F
סודיום דודציל סולפט (SDS)	Carl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)	2326.2
נוחות תרמיקוסר	Eppendorf (המבורג, גרמניה)	5355 000.011
TNF-α (10 מיקרוגרם/מ"ל)	Peprotech (המבורג, גרמניה)	300-01א
טריס	Carl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)	4855.3
תמיסה כחולה טריפאן (0.4	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, גרמניה)	T8154
טווין 20	Carl Roth GmbH (קרלסרוהה, גרמניה)	9127.1
Whatman 0.2 מיקרומטר קרום ניטרוצלולוז	GE Healthcare (זולינגן, גרמניה)	10600001
נייר כרומטוגרפיה WhatmanTM 3 מ"מ Chr	Fisher Scientific GmbH (Schwerte, גרמניה)	3030917

% %)