הערכת היעילות האנטי-סרטנית של חלבון אימונומודולטורי חיידקי במודל מורין

תקציר

מקור: Codolo, G. et al. הערכת היעילות של חלבון H. pylori HP-NAP ככלי טיפולי לטיפול בסרטן שלפוחית השתן במודל מורין אורתוטופי.J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת הפעילות האנטי-סרטנית של חלבון מפעיל נויטרופילים הליקובקטר פילורי, או HP-NAP, במודל סרטן שלפוחית השתן של עכבר. HP-NAP מקיים אינטראקציה עם נויטרופילים של תאי גידול כדי לייצר ציטוקינים מעודדי דלקת, וגורם להתמיינות של תאי T נאיביים לפנוטיפים של תאי T מסוג 1 (Th1) וציטוטוקסיים מסוג 1 (Tc1). תאי Th1 ו-Tc1 מפרישים אינטרפרון-גמא, מעכבים אנגיוגנזה של הגידול ומקדמים הרס גידול בתיווך תאי T ציטוטוקסיים, תוך הפחתת נפח הגידול.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בעלי חיים

1. לגדל עכברות C57BL6/J עד גיל 8 שבועות בכלובים מאווררים בנפרד עם מסנני מיקרו-בידוד.
   הערה: נקבות מועדפות מכיוון שהקונפורמציה האנטומית של מנגנון השתן החיצוני שלהן הופכת את הצנתור לקל יותר מאשר אצל זכרים.

2. תרבית תאים

1. שמור על קו תאי קרצינומה של דרכי השתן בעכבר MB49 במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% סרום בקר עוברי מומת בחום ו-50 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ב-37°C ב-5% פחמן דו-חמצני לח (CO₂).
2. לגדל תאי MB49 בצלוחיות T-75 למפגש של 80%. טריפסיניזציה והשעיה מחדש ב 0.5 × 10⁵ - 0.5 × 10⁶ תאים לכל 150 מיקרוליטר של מלח חוצץ פוספט (PBS) לפני ההשתלה בעכברים.

3. שתל גידול תוך שלפוחית

1. מרדימים עכברים באמצעות תערובת של חומרי ההרדמה זולטיל וקסילור (33 מ"ג/ק"ג ו-20 מ"ג/ק"ג, בהתאמה), בהזרקה תוך צפקית.
2. הניחו בעלי חיים במצב שכיבה וקיבעו את הרגליים האחוריות לכרית בעזרת סקוטש טייפ. כפות הרגליים חייבות להיות מופרדות מספיק כדי להפוך את בשר השופכה לגלוי היטב ונגיש בקלות להחדרת קטטר.
3. הערה: לצנתור, צנתר ורידי ילדים 24 גרם מתאים לעכברים בני 8 עד 10 שבועות. בחירת הצנתר היא קריטית למניעת דליפת נוזלים בין דופן השופכה לצנתר. יש להשתמש בצנתרים גדולים יותר עבור עכברים גדולים או מבוגרים יותר.
4. בעזרת פטמה קטנה, צבטו קצה אחד של החלק החיצוני של השופכה וסובבו אותו בעדינות רבה לכיוון "קצה הראש" של העכברים. פעולה זו חושפת את בשר השופכה.
5. הסר את המחט הפנימית של הצנתר והכנס את האחרון לשופכה בזווית של 45 מעלות, בכיוון קל לכיוון "קצה הזנב" של העכברים. אין לכפות את כניסת הצנתר; במקרה של התנגדות, פשוט סובבו את הצנתר בעדינות רבה עד שהוא מחליק לתוך השופכה. כאשר כ-0.5-0.8 ס"מ מהקטטר נמצא בשופכה, מניחים בזהירות את הצנתר במקביל לזנב העכברים ומחדירים אותו לחלוטין.
6. באמצעות מזרק 1 מ"ל, המחט של אשר יש להחדיר לקטטר, לשטוף את שלפוחית השתן משאריות שתן על ידי הזרקת 200-300 μl של PBS סטרילי ולשאוף את כל הנוזלים משלפוחית השתן.
7. הערה: בעת הזרקת PBS, שלפוחית השתן תתמלא, ונפיחות תיראה בין הרגליים האחוריות של העכברים; זה מאשר כי הצנתור נכון. לרוב הצנתרים יש נפח מת שיש לקחת בחשבון בעת חישוב נפח ההזרקה.
8. באמצעות מזרק סטרילי 1 מ"ל, להזריק 200 μl של 0.1 N חומצה הידרוכלורית (HCl). מלאו את שלפוחית השתן כדי לשרוף את כל הדופן שלה. לאחר 10 שניות, להסיר את כל החומצה ולנטרל מיד על ידי הזרקת 200 μl של 0.1 N נתרן הידרוקסידי (NaOH) עם מזרק סטרילי. במקרה של הזרקת המספר הגבוה ביותר של תאים (0.5 × 10⁶), שלב ההחמצה אינו נדרש.
9. לשאוף את כל הנוזל השיורי מיד לשטוף את החלל עם 300 μl של PBS סטרילי.
10. רוקן את שלפוחית השתן על ידי שאיפה והזריק 150 μl של PBS המכיל תאי MB49 (טווח 0.5 × 10,⁵ - 0.5 × 10,⁶) לתוך שלפוחית השתן. השאירו את המזרק מורכב לקטטר כדי למנוע דליפה של תאים. עדיף לאבטח את המזרק על ידי קיבוע אותו לרפד עם סרט סקוטש.
11. לאחר שעה, מוציאים בעדינות את הצנתר מהשופכה ומניחים את העכברים בכלוב מתחת למנורת ליבון עד שהם מתעוררים: זה קורה בדרך כלל בין שעה לשעתיים לאחר סיום הטיפול.

4. אספקה תוך-שלפוחית של חלבון מפעיל נויטרופילים הליקובקטר פילורי (HP-NAP)

1. הערה: לפחות 3 ימים לאחר החדרת התא, ניתן להתחיל את הטיפול.
2. צנתור כמתואר בשלבים 3.1 עד 3.4. בשלב זה, אין צורך לשרוף את דופן שלפוחית השתן עם HCl.
3. באמצעות מזרק 1 מ"ל, לשטוף את שלפוחית השתן משאריות שתן על ידי הזרקת 200-300 μl של PBS סטרילי ולשאוף את כל הנוזלים משלפוחית השתן.
4. הזריקו 50 מיקרוגרם HP-NAP לכל 150 מיקרוליטר PBS לשלפוחית השתן. השאירו את המזרק מחובר לקטטר כדי למנוע דליפה של תמיסת החלבון. אבטחו את המזרק על ידי קיבוע שלו לרפד עם סקוטש טייפ.
5. לאחר שעה, הוציאו בעדינות את הצנתר מהשופכה והכניסו את העכברים לכלוב מתחת למנורת ליבון עד שיתעוררו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נקבות עכברים C57BL/6J	Harlan Italy (אודינה, איטליה)
תאי MB49			התקבל מפרופ' אודונל, אוניברסיטת איווה Carver College of Medicine, איווה, ארה"ב
סל"ד	סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב)	₪220
פ.ב.ס.	סיגמא-אולדריץ'	F7524
PBS	סיגמא-אולדריץ'	D1408	10X, להיות מדולל במים פירוגניים
בקבוק	בקטון דיקינסון (פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב)	353135
מזרק 1 מ"ל	בקטון דיקינסון	301358
טריפסין	Life Technologies (וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב)
ג'נטמיצין	לייף טכנולוגיות	15710-049
שילור	Bio 98 s.r.l. (Milano, איטליה)		2% קסילזין
זולטיל	Virbac (Carros, צרפת)	3.59713E+11	5% זולאזפם + 5% טילטמין
24G קטטר	Terumo (רומא, איטליה)	SR+DM2419PX
HCl	Carlo Erba Reagents (Milano, איטליה)	403871	נוזל
נאוה	JT Baker (סנטר ואלי, פנסילבניה, ארה"ב)	10095011	אבקה