$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים המערבים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי local
הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים וועדת הביקורת הווטרינרית JoVE. כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. יצירת תאי CD8+ T נגיפיים ספציפיים ל- Ag מתאי iPSC (תאי T iPSC-CD8+)
- יצירת מבנים רטרו-ויראליים
הערה: קולטן תאי T (TCR) α וגנים β מקושרים לרצף 2A של ניתוק עצמי. הווקטור הרטרו-ויראלי MSCV-IRES-DsRed (MiDR) הוא DsRed+.
- תת-שיבוט HBs183-191 (FLLTRILTI)-גנים היברידיים ספציפיים A2 מוגבלים לבני אדם (s183 TCR) (Vα34 ו-Vβ28) לתוך MiDR כדי ליצור את מבנה ה-MiDR s183 (איור 1A).
- טרנסדוקציה רטרו-ויראלית
הערה: תאי Platinum-E (Plat-E) משמשים לאריזת רטרו-וירוסים (הנושאים גנים s183 TCR), אשר ישמשו להתמרה רטרו-ויראלית. תאי Plat-E הם תאי אריזה רטרו-וירוס יעילים העומדים בבסיס תאי 293T, אשר פותחו באמצעות מבני אריזה ייחודיים באמצעות מקדם EF1α כדי לבטא חלבון מבנה רטרו-ויראלי, כולל gag, pol ו- env אקוטרופי.
- על צלחת תרבית 100 מ"מ, זרע 3 x 106 תאי Plat-E ב 8 מ"ל של מדיום תרבית DMEM המכיל 10% סרום עגל עוברי (FCS) באינקובטור ב 37 ° C עם 5% CO2, 1 יום לפני transfection.
- ביום 0, הדבק את מבנה s183 MiDR לתוך תאי Plat-E באמצעות מגיב טרנספקציה DNA.
- ביום הראשון, זרעו 1 x 106 iPSCs (חלבון פלואורסצנטי ירוק [GFP]+) לתוך צלחת תרבית מצופה מראש בג'לטין.
- בימים 2-3, אספו סופרנאטנט המכיל רטרו-וירוסים מתרבית תאי Plat-E כדי להתמיר iPSCs עם s183 TCR בנוכחות תמיסת 1,6-dibromohexane.
- ביום הרביעי, טריפסין את iPSCs המומרים גנטית s183 TCR, צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות, וזרע 3 × 105 iPSCs בצלחת תרבית 100 מ"מ מצופה מראש עם 3 x 106 תאים מזינים SNL76/7 (irSNL76/7) מוקרנים.
- ביום 5 או 6 של מפגש, טריפסינזציה של התאים, צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות, ותהליך למיון תאים. על תאים חיים, מיין GFP ו- DsRED תאים חיוביים כפולים (iPSCs מומרים גנטית s183 TCR) באמצעות ממיין תאים במהירות גבוהה. בדומה לשלב 1.2.5, תרבית משותפת של התאים הממוינים על תאי הזנה irSNL76/7 לשימוש עתידי.
- התמיינות של תאי T iPSC-CD8+ ספציפיים ל-HBV
הערה: תאי הסטרומה OP9-DL1/DL4 מבטאים יתר על המידה הן את ליגנדות Notch DL1 והן את DL4, ותרבית משותפת של iPSCs עם iPSCs יכולה לקדם התמיינות תאי T בתיווך איתות Notch.
- גדל iPSCs מומרים גנטית s183 TCR (s183/iPSCs) בחד-שכבה של תאים OP9-DL1-DL4 במדיה בינונית חיונית מינימלית (MEM) של α המכילה 20% סרום בקר עוברי (FBS). כלול מורין FMS דמוי טירוזין קינאז 3 (Flt3) ליגנד (mFlt-3L; ריכוז סופי = 5 ng/mL) בתרבית.
- ביום 0, זרעו 0.5-1.0 x 105 S183/iPSCs בצלחת תרבית בקוטר 10 ס"מ שגודלה בעבר עם תאי OP9-DL1-DL4. ודא שתאי OP9-DL1-DL4 נמצאים במצב של מפגש של 80%-90%.
- ביום החמישי, שטפו את תאי הגזע הפלוריפוטנטיים הפלוריפוטנטיים (iPSCs) עם 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), שאפו מה-PBS, הוסיפו זאת ל-4 מ"ל של 0.25% טריפסין, ודגרו באינקובטור של 37°C למשך 10 דקות. לאחר מכן, הוסיפו תוספת של 8 מ"ל של חומר iPSC כדי לסיים את עיכול הטריפסין. צברו את כל תמיסות העיכול המכילות את התאים והצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 15-30 מעלות צלזיוס.
- לשאוף את supernatant ו resuspend תאים ב 10 מ"ל של מדיה iPSC. מעבירים את תרחיף התא לצלחת פטרי חדשה בקוטר 10 ס"מ ודגרים באינקובטור למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C.
- לאחר 30 דקות, אסוף את מדיית iPSC המכילה את התאים הצפים. העבירו את מתלה התא דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר וחשבו את מספר התא.
- זרע 5 x 105 תאים בצלחת התרבית שגודלו בעבר תאי OP9-DL1-DL4 במצב של 80%-90% במפגש, כמתואר בשלב 1.3.1.
הערה: עבור התמיינות תאי T, כל 2-3 ימים, התאים שמקורם ב- iPSC צריכים לזרוע מחדש עם שכבה חדשה של תאי OP9-DL1-DL4.
- הערכה
- שינויים מורפולוגיים של iPSCs מבדילים
- התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ בימים שונים.
הערה: ביום החמישי, למושבות יש מאפיינים דמויי מזודרם, המציגות מורפולוגיה קלאסית בצורת ציר המזכירה פיברובלסטים עוריים אנושיים וצמיחה מתמשכת במבחנה. ביום 8, אשכולות עגולים קטנים של תאים מתחילים להופיע.
- ניתוח הבחנה של iPSCs על ידי ציטומטריית זרימה
- בימים שונים של תרבית משותפת, נתחו תאים שמקורם ב-iPSC כפי שתואר קודם לכן (איור 1B,C).
- ניתוח פונקציונלי של iPSCs מבדילים
- ביום ה-28 של התרבית המשותפת, אספו תאי T מסוג iPSC-CD8+ מתרביות על ידי קצירת התאים הצפים, טריפסינזציה של שאריות התאים עם 0.25% טריפסין, השהו מחדש ב-8 מ"ל של מדיה iPSC, צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-400 x גרם ב-15-30 מעלות צלזיוס, הסירו את המדיה ואז השעו מחדש את התאים ב-10 מ"ל מדיה.
- שמור את התאים המרחפים מחדש בצלחת טרייה של 10 ס"מ באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות והרכיב את התאים הצפים. לאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת עם PBS קר.
- דגירה 3 x 106 T טחול מדולדל תאים (CD4-CD8-) מטחול של H-2 סוג I נוקאאוט, עכברים HLA-A2.1-transgenic (HHD) עם 5 μM s183 פפטיד (FLLTRILTI) ב 200 μL של מדיה ב 4 ° C במשך 30 דקות.
- לייצר תערובת של תאי T iPSC-CD8+ עם splenocytes פועם פפטיד s183 (תאי T: splenocytes = 1: 4; להשתמש 0.75 x 106 תאי T). לדגור על תערובת התאים ב 37 ° C באינקובטור CO2 במשך 40 שעות. במהלך 7 השעות האחרונות, הוסיפו 4 מיקרוליטר של ברפלדין A מדולל לתרבית (ריכוז סופי של פי 1,000, אשר ידולל בתרבית 1x) כדי לחסום תהליכי הובלה במהלך הפעלת התא.
- לצבוע את התאים ולבצע ניתוח ציטומטרי זרימה של אינטרפרון-גמא תוך-תאי (IFN-γ) כפי שתואר קודם לכן (איור 2).
2. השראת שכפול HBV באמצעות העברה הידרודינמית של פלסמיד HBV
הערה: מבנה pAAV/HBV1.2 נוצר כמתואר קודם לכן. הדנ"א המלא HBV 1.2 משולב ב-pAAV הווקטורי.
- משלוחים הידרודינמיים של פלסמיד HBV דרך וריד הזנב
- חממו עכברי HHD באמצעות מנורת חום למשך 5 דקות בכלוב על מנת להרחיב את וריד הזנב.
- יש לעצור את בעל החיים באמצעות ריסון, ולנקות זנבות עכבר עם תרסיס אתנול 70%.
- משלוח פלסמיד לתוך הכבד.
- מדוד את משקל הגוף של העכבר באמצעות סולם מדידה.
- לדלל 10 מיקרוגרם של פלסמיד HBV בשווה ערך של 8% של מסת הגוף PBS (למשל, 1.6 מ"ל עבור עכבר 20 גרם). טען פלסמיד מדולל במזרק 3 מ"ל עם מחט היפודרמית 26 גרם × 1⁄2" (0.45 × 12 מ"מ).
- אתר את אחד משני ורידי הזנב הצדיים בשליש האמצעי של הזנב ומקם את המחט בתוך כל אחד מהוורידים הרוחביים. לנהל את הזריקה המכילה פלסמיד HBV דרך וריד הזנב בתוך 3 - 5 שניות.
- כימות וירמיה מסרום דם של עכברים נגועים
הערה: שכפול HBV מתרחש מהיום 3-35 בסרום העכבר. שכפול הדנ"א מגיע לשיאו ביום השביעי ופוחת בהדרגה. הדנ"א של HBV לא מנוקה מהסרום עד היום ה-35.
- איסוף נסיוב דם מעכברים נגועים
- יש לאסוף כ-0.1 מ"ל דם בצינור מיקרוצנטריפוגה מכל עכבר במשך 3, 5, 7 ו-10 ימים לאחר ההדבקה על ידי דימום רטרו-אורביטלי בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, ולאחר מכן לדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך 20 דקות.
- צנטריפוגה את הדגימה ב 6,000 x גרם במשך 15 דקות ב 4 ° C ולאסוף את supernatant בסרום לאחר צנטריפוגה.
- לטהר את הדנ"א מסרום הדם באמצעות ערכת מיצוי DNA מסחרית בהתאם להמלצות היצרן. בקצרה, לשכב את התאים בטור מבוסס סיליקה, לבצע שטיפות, ולחלץ DNA על ידי הוספת 100% אתנול לעמוד elution צנטריפוגה ב 6000 x גרם במשך 1 דקה. להאיר את הדנ"א ב 50 μL של מים נטולי RNase.
- השתמש 100 ng של DNA HBV מן elution עבור ניתוח PCR בזמן אמת. השתמש בפריימרים ובבדיקות הבאים: קדימה 5' TAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG 3'; הפוך 5' GCACAGCTTGGAGGCTTGT 3'; בדיקה 5' TCACCTCTGCCTAATC 3'.
- השתמשו בגנום HBV המכיל פלסמיד (pAAV/HBV1.2) עבור העקומה הסטנדרטית ובצעו PCR בזמן אמת בנפח כולל של 10 μL (איור 3).
- הגדר את תגובת ה-PCR בנפח כולל של 10 μL, כפי שמוצג בטבלה 1.
- הגדר את תוכנית ה- PCR ב- thermocycler, כפי שמוצג בטבלה 2. קצב מעבר הטמפרטורה המתוכנת הוא 20 ° C / s עבור דנטורציה / חישול ו 5 ° C / s עבור הארכה. מדוד את הפלואורסצנטיות בסוף שלב החישול עבור כל מחזור לניטור PCR בזמן אמת.
3. הפחתת שכפול HBV על ידי ACT של תאי T iPSC-CD8+ ספציפיים ל- Ag נגיפיים
- העברת תאים מאומצת (ACT)
- התמיינות s183/iPSCs (1.3.7) בתאי סטרומה OP9-DL1-DL4 בנוכחות mFlt-3L ו-mIL-7 למשך 8 ימים, כמתואר בסעיף 1.3.
- ביום ה-22, אספו תאי T מסוג iPSC-CD8+ מהצלחת בקוטר 10 ס"מ עם טריפסין, ולאחר מכן שטפו והשהו מחדש כל צלחת בקוטר 10 ס"מ ב-10 מ"ל של מדיה טרייה. מוסיפים את התאים לצלחת טרייה בקוטר 10 ס"מ ומחזירים לאינקובטור למשך 30 דקות, כפי שנעשה בסעיף 1.3. לאחר 30 דקות, אספו תאים צפים.
- השתמש במסננת ניילון של 70 מיקרומטר כדי להעביר תאים כדי לחסל אשכולות תאים ולספור את מספר התא. התאימו את התאים לריכוז של 1.5 x 107 תאים/מ"ל בתמיסת PBS קרה והשתמשו במסננת ניילון של 70 מיקרומטר כדי להעביר תאים כדי לחסל שוב את אשכולות התאים במידת הצורך. שמור תאים על קרח עד ACT.
- הזריקו תרחיף תאים של 200 μL (3 x 106 תאים) לעכברי HHD בני 4-6 שבועות דרך וריד הזנב.
- אינדוקציה של שכפול HBV
- ביום ה-14 לאחר העברת התא, בצע את ההעברה ההידרודינמית של פלסמיד HBV דרך וריד הזנב כמתואר בסעיף 2.1.
טבלה 1: נפח תגובת PCR
| תבנית DNA | 2 מ"ל |
| תערובת הכלאה ראשית של DNA (Taq DNA פולימראז, מאגר תגובת PCR, 10 mM MgCl2 ותערובת dNTP) | 1 מ"ל |
| 25 מ"מ MgCl2 | 0.8 מ"ל |
| 0.3 מיקרומטר הגשושית | 3 מ"ל |
| 5 מיקרומטר מכל פריימר | 3.2 מ"ל |
| סך | 10 מ"ל |
טבלה 2: תוכנית PCR
| דנטורציה | טמפרטורה
95 °C | זמן
5 שניות |
| חישול | 53 °C | 10 שניות |
| סיומת | 72 °C | 20 שניות |
| 5 °C | |
