דיכוי שכפול נגיף הפטיטיס B באמצעות תאי T ספציפיים לאנטיגן נגיפי

Abstract

מקור: Xiong, X., et al. תאי גזע נגיפיים אג ספציפי T לימפוציטים לדכא שכפול HBV בעכברים. J. Vis. Exp. (2019).

הסרטון מדגים בדיקה באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSC) שמקורם בתאי CD8+ T כדי לעכב שכפול נגיף הפטיטיס B (HBV) בעכברים. תאי T אלה, שהונדסו עם קולטנים ספציפיים ל-HBV, מועברים לעכברים טרנסגניים. פלסמידים של גנום HBV בעלי יכולת שכפול מוזרקים ישירות לכבד, ומאפשרים ספיגת DNA נגיפי. ברגע שאנטיגנים נגיפיים באים לידי ביטוי ומוצגים על ידי מולקולות MHC-I היברידיות, תאי T מהונדסים מזהים קומפלקסים אלה ונקשרים אליהם. זה מעורר שחרור של מולקולות ציטוטוקסיות, וכתוצאה מכך הרס של תאי כבד נגועים HBV ודיכוי של שכפול ויראלי.

Protocol

כל ההליכים המערבים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי local
הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים וועדת הביקורת הווטרינרית JoVE. כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. יצירת תאי CD8⁺ T נגיפיים ספציפיים ל- Ag מתאי iPSC (תאי T iPSC-CD8⁺)

1. יצירת מבנים רטרו-ויראליים
   הערה: קולטן תאי T (TCR) α וגנים β מקושרים לרצף 2A של ניתוק עצמי. הווקטור הרטרו-ויראלי MSCV-IRES-DsRed (MiDR) הוא DsRed+.
   1. תת-שיבוט HBs183-191 (FLLTRILTI)-גנים היברידיים ספציפיים A2 מוגבלים לבני אדם (s183 TCR) (Vα34 ו-Vβ28) לתוך MiDR כדי ליצור את מבנה ה-MiDR s183 (

Results

איור 1: יצירת תאי T מסוג iPSC-CD8⁺ ספציפיים ל-HBV ויראליים.

תאי iPSC של עכבר מומרים עם המבנים הרטרו-ויראליים הבאים: HBs183-91 TCR (MiDR-s183 TCR) או OVA257-264 TCR (MiDR-OVA TCR), וה-iPSCs המומרים מתורבתים יחד עם תאי סטרומה OP9-DL1/DL4 עבור התמיינות שושלת T. (A) ייצוג סכמטי של המבנה הרטרו-ויראלי MiDR-s183 TCR המבטא TCR ספציפי ל-s183. Ψ = אות אריזה; 2A = פיקורנוו.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
עכברי HHD	Institut Pasteur, פריז, צרפת		H-2 Class I knockout, עכברי HLA-A2.1-transgenic (HHD)
iPS-MEF-NG-20D-17	בנק הסלולר RIKEN	APS0001
SNL76/7	ATCC	SCRC-1049
אופ9	ATCC	CRL-2749
פלסמיד pAAV/HBV1.2	ד"ר פיי-ג'ר צ'ן (בית החולים האוניברסיטאי הלאומי של טייוואן, טייוואן)		מבנה DNA HBV
HBs183-91(s183) (FLLTRILTI)-גנים ספציפיים ל-TCR	ד"ר אדם ג'יי גרינג (מכון המחקר של בית החולים הכללי בטורונטו, טורונטו, קנדה)		FLLTRILTI-specific A2-restricted human-murine hybrid TCR genes (Vα34 ו-Vβ28)
גנים ספציפיים ל-TCR מסוג OVA257–264	ד"ר דריו א. ויניאלי (אונ' פיטסבורג, פנסילבניה)		גני TCR מוגבלים H-2Kb ספציפיים ל- SIINFEKL
נוגדן נגד CD3 (17A2)	ביואגדה	100236
נוגדן נגד CD44 (IM7)	BD Pharmingen	103012
נוגדן נגד CD4 (GK1.5)	ביואגדה	100408
נוגדן נגד CD8 (53-6.7)	ביואגדה	100732
נוגדן נגד IFN-γ (XMG1.2)	ביואגדה	505810
נוגדן נגד TNF-a (MP6-XT22)	ביואגדה	506306
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
נוגדנים נגד HBs	תרמו פישר	MA5-13059
מאגר ACK Lysis	לונזה	10-548E
ברפלדין א	סיגמא	B7651
DMEM	Invitrogen	ABCD1234
פ.ב.ס.	היקלון	SH3007.01
סדרן תאי FACSAria Fusion	ב.ד.	656700
ג'לטין	MilliporeSigma	G9391
ג'ינג'אמר	אג'ילנט	204130
HLA-A201-HBs183-91-PE פנטאמר	פרואימוניות	F027-4A - 27
נוגדן משני HRP נגד עכבר	Invitrogen	A27025
mFlt-3L	פפרוטק	250-31 ליטר
mIL-7	פפרוטק	217-17
נוקלאז S7	רוש	10107921001
פרפורמאלדהיד	MilliporeSigma	P6148-500G	אזהרה: אלרגני, מסרטן, רעיל
מאגר חדירות	ביואגדה	421002
פוליברן	MilliporeSigma	107689
הרכבה ProLong™ Gold Antifade עם DAPI	Invitrogen	P36931
ערכת ספין וירוס QIAamp MinElute	קיאגן	57704