טיפול מבוסס תאים לדלקת מפרקים אוטואימונית במודל מורין

תקציר

מקור: Haque, M. et al., פיתוח תאי T רגולטוריים ספציפיים לתאי גזע נגד אוטואימוניות.J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מציג טיפול מבוסס תאים לדלקת מפרקים אוטואימונית בעכברים. תאי בקרת T שמקורם ב-iPSC המבטאים קולטנים ספציפיים לאובאלבומין מוזרקים עם אלבומין בסרום בקר שעבר מתילציה (mBSA) ומתחלב באדג'ובנט. תאים מציגי אנטיגן מורין (APCs) מעבדים ומציגים את mBSA לתאי T, מה שגורם להפעלת תאי T ונדידה לקרום הסינוביאלי של מפרק הברך. זריקות עוקבות כוללות mBSA לבד בברך שמאל ושילוב של mBSA ואובלבומין בברך ימין. בברך שמאל, התגובה החיסונית ל- mBSA מעוררת דלקת פרקים, ואילו בברך ימין, תאי T מווסתים אינטראקציה עם ovalbumin להפחית דלקת, שיפור תסמיני דלקת פרקים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. In Vivo התבגרות ודיכוי של דלקת מפרקים אוטואימונית

1. צור את המבנים שישמשו בהתמרה רטרו-ויראלית על ידי שיבוט משנה של הגנים קולטן תאי T OT-II (TCR) וחלבון קופסת מזלג 3 (FoxP3) לתוך פלסמיד MiDR המקושר עם פפטיד 2A החותך את עצמו כדי להפוך את MiDR-TCRα-2A-TCRβ-2A-FoxP3 לבנות.
2. בצע התמרה רטרו-ויראלית של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) באמצעות תאי Plat E כקו תאי האריזה.
3. התמיינות In vivo והשראת דלקת פרקים בעכברים.
   1. הבדיל בין iPSCs מומרים OT-II TCR/FoxP3 (OT-II-FoxP3/iPSCs), iPSCs מומרים FoxP3 ו- DsRed מתמרים iPSCs בתאי סטרומה OP9-DL1-DL4-I-A^b בנוכחות ציטוקינים mFlt-3L ו- mIL-7 למשך 8 ימים.
   2. ביום 0, זרעו תאי OP9-DL1-DL4-I-A^b בצפיפות מינימלית של 10⁴ תאים/ס"מ² באמצעות מדיה OP-9 (מדיה α-MEM המכילה 20% סרום עגל עוברי (FCS) ו-2.2 גרם/ליטר סודיום ביקרבונט. צלחת 1 x 10⁶ תאים לכל צלחת 10 ס"מ.
   3. ביום השלישי, כאשר תאי OP9-DL1-DL4-I-A^b הופכים ל-80-90% נפגשים, הסר את המדיה וזרע 0.5 - 1 x 10⁵ iPSCs מעל תאי OP9-DL1-DL4--I-A^b במדיה OP-9.
      הערה: פעולה זו מבססת את התרבות המשותפת של iPSCs על תאי OP9-DL1-DL4-I-A^b ונחשבת ליום 0 של התמיינות.
   4. ביום 5, להסיר את המדיה מן צלחת 10 ס"מ על ידי שאיפה, לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של 1x פוספט buffered מלוחים (PBS), ולשאוף את PBS. מוסיפים 4 מ"ל של 0.25% טריפסין ודגרים ב-37°C למשך 10 דקות. הוסף עוד 8 מ"ל של מדיה iPSC לתאים, להשהות אותם מחדש, צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      1. לשאוף את supernatant ולהשעות מחדש את התאים ב 10 מ"ל של מדיה iPSC. דוגרים על תאים מרחפים אלה על צלחת טרייה בקוטר 10 ס"מ וחוזרים לאינקובטור למשך 30 דקות.
         הערה: הסר את תאי ההזנה OP9-DL1-DL4-I-A^b ושמור את תאי ה- iPSC המבדילים במדיה. שמור על תאי OP9-DL1-DL4-I-A^b ברציפות כדי להשיג מפגש של 80 - 90% לתרבית משותפת נוספת.
      2. לאחר 30 דקות, לאסוף את התאים הצפים, לסנן אותם דרך מסננת תאים 70 מיקרומטר, ולספור אותם עם המוציטומטר.
   5. זרע 5 x 10⁵ של iPSCs למפגש טרי של 80 - 90% של תאי OP9-DL1-DL4-I-A^b במדיית OP9. יש להשלים את המדיה עם mFlt-3L בריכוז סופי של 5 נ"ג/מ"ל.
   6. טריפסיניזציה של כל שלושת סוגי התאים מהצלחת בקוטר 10 ס"מ והשעיית תאים מחדש מכל צלחת בקוטר 10 ס"מ במצע טרי בקוטר 10 מ"ל. מוסיפים את התאים לצלחת טרייה בקוטר 10 ס"מ ומחזירים לאינקובטור למשך 30 דקות. לאחר 30 דקות, אספו תאים צפים.
   7. העבירו תאים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר אשכולות תאים ולספור באמצעות המוציטומטר. כוונן את התאים לריכוז של 1.5 x 10⁷ תאים/מ"ל בPBS קר וסנן שוב במידת הצורך. שמור תאים על קרח עד להעברת תאים מאמצים לעכברים.
   8. הזריקו 200 μl של תרחיף התאים (3 x 10⁶ תאים) לשלוש קבוצות שונות של עכברי C57BL/6 נקבות בנות 4 - 6 שבועות דרך וריד הזנב.
   9. ביום ה-10, לאחר העברת התא, הזריקו לעכברים 100 מיקרוגרם אלבומין בסרום בקר שעבר מתילציה (mBSA) המתחלב באדג'ובנט המלא של פרוינד בבסיס הזנב באמצעות מזרק של 1 מ"ל.
   10. ביום ה-17, מרדימים עכברים באמצעות וופורייזר איזופלורן. יש להשתמש באיזופלורן 4-5% לאינדוקציה ו-1%-2% לתחזוקה. לגרום לדלקת פרקים על ידי הזרקה תוך מפרקית של 20 מיקרוגרם mBSA ב 10 μl PBS במפרק הברך השמאלית ושל 20 מיקרוגרם mBSA ו 100 מיקרוגרם ovalbumin שלם (OVA) ב 10 μl PBS במפרק הברך הימנית. מזון וחבילת ג'ל ניתן להניח על רצפת המצעים לאחר התפתחות דלקת פרקים. עכברים יעברו המתת חסד: ציון מצב גוף (BCS) של 2/5 או מוות, קכקסיה חמורה ו / או שכיבה מתמשכת (תקופה של 24 שעות), וציון חומרה של 4. בציון 4, אריתמה ונפיחות חמורה מקיפות את הקרסול, כף הרגל, וספרות, או ankyloses של האיבר.
4. אפיון iPSCs מתומר OT-II TCR/FoxP3.
   1. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי (20X) כדי להמחיש תאי DsRed⁺ GFP⁺ חיים לא קבועים.
   2. לבחון אינטגרציה וביטוי גנים הן על ידי כתם מערבי והן על ידי ציטומטריית זרימה.
5. בדיקת דיכוי דלקת פרקים
   1. מדוד את הנפיחות של שתי הברכיים של העכברים לפני השראת דלקת פרקים באמצעות קליפר מד חוגה כדי לבסס קו בסיס.
   2. בצע את השלבים (1.3.1 - 1.3.10) להשראת דלקת פרקים והעברת Treg. מדוד את ברכי העכבר באמצעות קליפר מד חוגה לאחר העברת Treg.
   3. חישוב אחוז הגידול בקוטר הברך: אחוז עלייה = (קוטר הברך ביום 1 - קוטר הברך ביום 0) / קוטר הברך ביום 0.
6. מדידת הרס מפרקים וחדירת תאים דלקתיים בברכיים באמצעות היסטולוגיה (איור 1).
   1. ביום השביעי לאחר השראת דלקת פרקים, יש להרדים את העכברים על ידי שאיפת פחמן דו חמצני (CO₂) ואחריה פריקת צוואר הרחם. הסר שיער מהברכיים עם קוצץ חשמלי והבלו את הברכיים בהליך כירורגי.
   2. הסר את העור מהרגליים על ידי ביצוע חתך ברגל האחורית עם מספריים קהים וחתך את העור לאורך הירך ועד הקרסול. מקלפים בעדינות את העור מעל הרגל וכף הרגל כדי לחשוף את השריר. הסר את השריר מהרגל בזהירות מבלי לפגוע במפרק הברך.
      1. חותכים את הרגל האחורית ממש מעל מפרק האגן/הירך וחותכים את השוקה בעזרת מספריים חדים לניתוח.
   3. לתקן את הברכיים ב 4% פורמלין במשך 48 שעות. Decalcize הברכיים באמצעות 2.5 M חומצה פורמית; יש לשטוף שלוש פעמים בקסילן במשך 3 דקות, לשטוף פעמיים באתנול 100%, לשטוף פעמיים באתנול 95%, לשטוף פעמיים במים נטולי יונים, ולסלקציה בחומצה אתילאנדיאמין-טראצטית (EDTA) ב-1 mM. יש לטפל בטמפרטורת רתיחה נמוכה (90°C) למשך 20 דקות.
   4. הסירו את שתי הברכיים, קבעו 10% פורמלין והסתיידו בפורמיקל-4. הטמיעו את הרקמות בפרפין, חתך בגודל 4 מיקרומטר, והכתימו עם המטוקסילין ואוזין (H & E) או ספרנין O מכתימים והתבוננו תחת מיקרוסקופ.

תוצאות

איור 1: העברה מאמצת של iPSC-Tregs ספציפי ל-Ag Ameliorates AIA בעכברים. תאי גזע מושרים מומרים עם המבנה הרטרו-ויראלי MiDR, MiDR-FoxP3 או MiDR-TCR-FoxP3 וגודלו בתרבית משותפת על תאי OP9-DL1/DL4/I-A^b. ביום השביעי, התאים המומרים גנטית (3 × 10⁶/עכבר) הועברו באופן מאומץ לנקבות C57BL/6 עכברים שהושרו עם AIA שבועיים לאחר העברת התא. ביום שלאחר השראת דלקת פרקים, חומרת דלקת ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
עכברי C57BL/6j	מעבדת ג'קסון	664
α-MEM	Invitrogen	A10490-01
פ.ב.ס.	היקלון	SH3007.01
פוליברן	סיגמא	107689
ג'ינג'אמר	מדע משולב	204130
mFlt-3L	פפרוטק	250-31 ליטר
mIL-7	פפרוטק	217-17
mBSA	סיגמא	A7906
אלבומין Ova	אוונטור	0440-01
CFA	דיפקו	2017014
ריסון Tailveiner	בריינטרי מדעית	RTV 150-STD
פרפורמאלדהיד	סיגמא	P6148-500G	אזהרה: אלרגני, מסרטן, רעיל