טכניקת Ex Vivo ליצירת תאי T קולטני אנטיגן כימריים ספציפיים לגידול

תקציר

מקור: Riccione, K., et al. Generation of CAR T Cells for Adoptive Therapy in the Context of Glioblastoma Standard of Care. J. Vis. Exp. (2015).

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת תאי T מסוג קולטן אנטיגן כימרי ספציפי לגידול (CAR). וקטורים רטרו-ויראליים הנושאים RNA מהונדס מעורבבים עם תאי טחול בתווך בתוספת אינטרלוקין-2 כדי לקדם הישרדות ושגשוג של תאי T. לאחר מכן התערובת מועברת לצלחת המצופה במקטעי פיברונקטין אנושיים רקומביננטיים וצנטריפוגה כדי להקל על איחוי הנגיף עם התא, מה שמאפשר לרנ"א להשתלב בגנום המארח ולייצר מכוניות הקשורות לפני השטח המכוונות לאנטיגן הגידול.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. כריתת טחול והכנת תאי T

יום 0:

1. יוצקים 10 מ"ל של מדיה תא T (TCM) לתוך חרוט 50 מ"ל ומניחים על קרח לאיסוף הטחול.
2. יש להקריב את המספר המתאים של בעלי חיים על ידי חנק_CO2 ועריפת ראשים משנית: הכניסו בעלי חיים לכלוב המקבל_CO2 בקצב זרימה של 10-30% נפח הכלוב לדקה, בהתאם להנחיות האגודה האמריקאית לרפואה וטרינרית (לא ניתן להקריב יותר מ-5 בעלי חיים בו זמנית) עד לסיום הנשימה ולמשך שתי דקות לאחר מכן. הסר בעלי חיים מתא CO₂ וערף את ראשם.
   הערה: טחול אחד של נקבת עכבר C57BL/6 בת 6-12 שבועות יניב כ 4.5-5 x 10⁷ טחול. כאן, 4 טחול ייקצר עבור כ 200 x 10⁶ תאים.
3. הניחו את העכבר כך שצדו הימני פונה כלפי מעלה, ורססו באתנול 70%. בעזרת המלקחיים, תופסים קפל עור דק מתחת לכלוב הצלעות השמאלי וחותכים חתך קל עם המספריים. מקלפים בחזרה את העור, תופסים בזהירות קפל דק של הצפק עם מלקחיים, וחותכים חלל קטן.
4. הטחול הוא איבר קטן, מוארך, אדום כהה הדומה לשעועית שטוחה; תופסים בעדינות את הטחול עם המלקחיים והבלו על ידי חיתוך רקמת החיבור שמסביב. מניחים את הטחול נכרת לתוך חרוט המכיל 10 מ"ל של TCM על קרח.
5. יוצקים את הטחול על מסננת של 70 מיקרומטר של תאי רשת ומתפרקים על ידי מעיכה עם הקצה הקהה של החלק הפנימי של מזרק 5 מ"ל ליצירת תרחיף חד-תאי. יש לפרק עד שני טחול לכל מסננת רשת.
6. השתמש בנפח קטן של TCM כדי לשטוף בזהירות את המסננת לאחר פירוק כדי לאסוף את כל הטחול שנותר. אגרו את כל הטחול המפורק, לתרחיף חד-תאי. יש להביא את הנפח הסופי ל-50 מ"ל עם TCM לשטיפה אחת ולסובב ב-300 x גרם למשך 10 דקות.
7. הכינו תמיסה של חיץ ליזיס 1x על ידי הוספת 5 מ"ל 10x חיץ ליזיס ל 45 מ"ל מים סטריליים. כדי לחסל תאי דם אדומים, גלולה להשהות ב 5 מ"ל של 1x lysis buffer לכל טחול ב 50 מ"ל חרוט, ערבוב היטב על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה. אם הכמות עולה על 5 טחול, יש להשתמש בצינור צנטריפוגה בנפח 250 מ"ל. הניחו צינור חרוטי או צנטריפוגה באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות.
8. הסר את תגובת הליזיס מאמבט המים והוסף TCM ביחס של 1:1 עם חיץ ליזיס כדי לנטרל את התגובה. שטפו על ידי ספינינג ב 300 x גרם במשך 10 דקות.
9. יש לשאוף סופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה באופן מלא ב-TCM (2 מ"ל/טחול, 8 מ"ל סה"כ ל-4 טחול) על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
10. ספירת תאים על-ידי הוספת 10 μl של תרחיף תאים ל-190 μl טריפאן כחול (דילול 1:20). הכפל את המספר המתקבל באחד מארבעת הריבועים המחוברים לרשת ב- 20 x 10⁴ x נפח כולל (8 מ"ל) כדי לקבל את מספר התא הכולל (לדוגמה, 125 תאים x 20 x 10⁴ x 8 מ"ל = 200 x 10⁶ טחול).
11. לדלל תאים לריכוז של 2 x 10⁶ תאים/מ"ל ב- TCM, בתוספת 2 מיקרוגרם/מ"ל concanavalin A (ConA) ו- 50 IU/ml רקומביננטי אנושי אינטרלוקין-2 (rhIL-2). לכן, עבור 200 x 10⁶ splenocytes, להוסיף 92 מ"ל מדיה 8 מ"ל תאים, 200 מיקרוגרם ConA, ו 5,000 IU rhIL-2.
12. הוסף 2 מ"ל תאים לכל באר של 24 צלחות מטופלות בתרבית רקמות, כך שבכל באר יהיו 4 x 10⁶ תאים (למשל, 100 מ"ל תאים ידרשו כ -4 צלחות).
13. יש לדגור למשך הלילה ב-37°C עם 5% CO₂.

2. התמרה

יום 1:

1. חישוב מספר תרביות שאינן רקמה שטופלו ב-24 צלחות הדרושות להתמרה על ידי הכפלת מספר הטחול שנקטף ב-2 (8 צלחות דרושות ל-4 טחול).
2. לאחר מכן, חשב את הנפח הנדרש של תמיסת שבר פיברונקטין אנושי רקומביננטי (RHFF) הדרוש לציפוי צלחות על ידי הכפלה (מספר כולל של בארות + 3) x 0.5 מ"ל (8 צלחות x 24 בארות = 192 + 3 = 195) x 0.5 מ"ל = 97.5 מ"ל.
3. הכינו 97.5 מ"ל מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל RHFF בריכוז של 25 מיקרוגרם/מ"ל על ידי הכפלת הנפח הכולל ב-25 מיקרוגרם (97.5 x 25 = 2437.5 מיקרוגרם). הוסף כמות זו של RHFF ל- PBS של 97.5 מ"ל.
4. תרבית מעיל ללא רקמה טיפלה בצלחות 24 בארות על ידי הוספת תמיסת PBS/RHFF של 0.5 מ"ל לכל באר.
5. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).

יום 2:

6. תמיסת PBS / RHFF מתרבית שאינה רקמה מטופלת בצלחות 24 בארות.
7. יש להוסיף אלבומין בסרום בקר (BSA) בנפח 1 מ"ל/באר 2% ב-PBS ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
8. הסר BSA על-ידי הפיכת הצלחת בחוזקה. יש לשטוף על ידי הוספת PBS של 2 מ"ל.
9. לאסוף supernatant ויראלי על ידי העברת מדיה מכל כליה עוברית אנושית 293T (HEK293T)-poly-D-lysine (PDL) מצופה צלחת לתוך צינור צנטריפוגה 250 מ"ל ולסובב 10 דקות ב 500 x גרם.
10. העבירו בזהירות סופרנאטנט ויראלי לצינור צנטריפוגה טרי של 250 מ"ל, תוך הקפדה שלא להפריע לכדורית התא שאולי נוצרה.
11. הוסיפו TCM טרי לסופרנאטנט הנגיפי כך שהנפח הסופי הוא 3 מ"ל יותר מהכמות הדרושה לבארות מצופות RHFF. לדוגמה, עבור 192 בארות מצופות RHFF, להביא את נפח supernatant ויראלי ל 192 + 3 מ"ל = 195 מ"ל.
12. הסר splenocytes תרבית מן האינקובטור ו resuspend על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה 2-3 פעמים בכל באר. מעבירים לחרוט של 250 מ"ל. אם משתמשים בפיפט רב ערוצי, שימוש במאגר סטרילי לפני ההעברה יסייע לזרז שלב זה. יש לספור כפי שתואר קודם ולסובב במהירות של 300 x גרם למשך 10 דקות.
13. הוסף אינטרלוקין-2 רקומביננטי אנושי (rhIL-2) לסופרנאטנט נגיפי בריכוז של 50 IU/ml. לדוגמה, הוסף 50 x 195 = 9,750 IU rhIL-2 ל 195 מ"ל של supernatant נגיפי.
14. השהה מחדש את הטחול בסופרנאטנט נגיפי ב 1 x 10⁶ תאים/מ"ל
15. הוסיפו 1 מ"ל/באר של תרחיף טחול לצלחות 24 בארות מצופות RHFF.
16. סחרור במשך 90 דקות בהתאם להגדרות הבאות: 770 x גרם, האצה = 4, בלימה/האטה = 0, 32 °C.
17. הכינו תמיסת TCM עם 50 IU/ml rhIL-2. לדוגמה, הכינו תמיסה של 200 TCM על ידי הוספת 10,000 IU rhIL-2. יש להוסיף 1 מ"ל של rhIL-2/TCM לכל באר לאחר הצנטריפוגה.
18. תרבית לילה ב 37 °C ב 5% CO₂.

3. תרבית תאי CAR T וקציר

ימים 3 ו-4:

1. אם תאי T משיגים מפגש של >80%, התאים עשויים להתפצל (זה קורה בדרך כלל ביום 3 או ביום 4). כדי לפצל תאים, צנרת בעדינות למעלה ולמטה בכל באר 2-3 פעמים, ולהעביר 1 מ"ל מכל באר לתוך בארות חדשות של צלחת טרייה 24 בארות טיפול בתרבית רקמות. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של TCM טרי עם 50 IU/ml IL-2 לכל באר כך שהנפח הסופי הוא 2 מ"ל בכל הבארות.
2. אם התאים אינם מגיעים למפגש של >80%, בצע שינוי חצי מדיה על ידי פיפטציה איטית של 1 מ"ל של מדיה מהחלק העליון של כל באר. הימנע מתאים מטרידים התיישבו על התחתית בעת הסרת מדיה. יש להוסיף 1 מ"ל של TCM טרי המכיל 50 IU/ml rhIL-2.

יום 5:

3. יש להשהות מחדש תאי CAR T על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה 3 פעמים בכל באר ולהעביר לצינור צנטריפוגה של 250 מ"ל. סובב תאים במהירות של 300 x גרם למשך 10 דקות.
לגמרי
4. לשאוף supernatant מבלי להפריע גלולה. יש לשטוף פעם אחת עם PBS, לספור תאים כפי שתואר קודם לכן, ולשטוף עם PBS פעם נוספת. תפוקת תאי CAR T טיפוסית היא בערך 1 x 10⁶ תאים לכל באר (8 לוחות x 24 בארות = 192 x 10⁶ תאי CAR T).
5. תאי השעיה מחדש ב- PBS בריכוז של 5 x 10⁷/ml להזרקה של 1 x 10⁷ בנפח של 200 מיקרוגרם (למשל, עבור 192 x 10⁶ תאי CAR T, להשהות מחדש גלולה שטופה ב 3.84 מ"ל PBS).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Concanavalin A	סיגמא אולדריץ'	C2010	מיטוגן לא ספציפי לגרימת התרבות תאי T והתמרה ויראלית
RPMI 1640	לייף טכנולוגיות	11875-093	מדיה של תרבית תאי T
אלבומין בסרום בקר (BSA), חלק V - ציון סטנדרטי	מוצרי Gemini Bio	700-100P	חוסם קשירה לא ספציפית של רטרווירוס ללוחות מצופים רטרונקטין
פארם ליז (10X תרכיז)	BD Biosciences	555899	שוכב תאי דם אדומים במהלך עיבוד טחול
70 מיקרומטר מסננות תאים סטריליים	קורנינג	352350	מסנן חלקיקי רקמה גדולים במהלך עיבוד הטחול
100 מ"מ BioCoat תרבית כלים עם פולי-די-ליזין	קורנינג	356469	מקדם הידבקות תאי HEK293 כדי למקסם את ההתרבות לאחר טרנספקציה
דימתיל סולפוקסיד	סיגמא מדעי החיים	D2650	הכרחי לפירוק מוחלט של temozolomide
מלוחים	הוספירה	IM 0132 (5/04)	ממס עבור temozolomide וקטמין/xylazine
קטתזיה הידרוכלוריד	הנרי שיין בריאות בעלי חיים	11695-0701-1	תמיסת קטמין
אנסד	לויד בע"מ	לא ישים	תמיסה סטרילית קסילזין 100 מ"ג/מ"ל