כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון. כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. התרחבות לא ספציפית של לימפוציטים ציטוטוקסיים מסוג T
- להכין ולהקרין תאי הזנה ב 35 Gy. לגירוי של 2 x 105 - 4 x 105 תאים משפיעים, הכינו 10 x 106 תאים חד-גרעיניים היקפיים בדם (PBMCs) ו- 1 x 106 קווי תאים לימפובלסטואידים מסוג B (BLCLs) משלושה תורמים מובחנים ובריאים.
- יש להשהות מחדש הן את תאי ההזנה והן את תאי ההשפעה ב-15 מ"ל של מדיום Roswell Park Memorial Institute (RPMI) בתוספת 10% סרום עגל עובר מומת בחום (FCS), 2 מילימ"ר L-גלוטמין, פניצילין (100 IU/mL) וסטרפטומיצין (0.1 מיקרוגרם/מ"ל) ו-300 IU/mL אינטרלוקין-2 רקומביננטי (IL-2).
- מוסיפים פיטוהמגלוטינין (PHA-L) בריכוז סופי של 1 מק"ג/מ"ל, מערבבים בזהירות ומפזרים 150 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל באר בלוחות בעלי תחתית U של 96 בארות.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ועם 5%CO2 באטמוספירה לחה.
- בדוק מדי יום את הצלחת עד להיווצרות גושי תאים גדולים בבארות התרבית (~ יום 7).
- מעבירים את התאים לבקבוק תרבית בגודל 1X106 תאים/מ"ל בתווך תרבית טרי.
- קבע את מספר התאים הכולל על ידי ספירה (2 פעמים בשבוע) ושמור אותם על 1 x 106 תאים / מ"ל בתרבית טרייה בינונית.
הערה: תאי החיסון המשפיעים צריכים להיות מוכנים למתן הטיפולי במצב מנוחה (בדרך כלל 3 שבועות לאחר גירוי ההגברה הראשוני). יש לבדוק את הטוהר והתגובתיות של תאי השפעה אלה לפני זריקות in vivo (למשל, עם בדיקות in vitro).
2. הכנת תאי השפעה לפני הניתוח
- לאחר בדיקת ספירת תאי האפקטור, אסוף את תאי האפקט בצינור 50 מ"ל באמצעות צנטריפוגה (300 x גרם למשך 5 דקות).
הערה: כדי לפצות על כל אובדן, להכין עודף של תאים (למשל, 50 x 106).
- בזהירות להסיר את supernatant ו resuspend את התאים ב 15 מ"ל של PBS סטרילי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 x גרם כדי לבצע את השטיפה.
- בזהירות ולחלוטין להסיר את supernatant ולאחר מכן להשעות מחדש את כדור התא ב 1 מ"ל של PBS סטרילי.
- העבר את התאים המרחפים מחדש במיקרו-צינור של 1.5 מ"ל לצנטריפוגה במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות.
- בזהירות ולחלוטין להסיר את supernatant על ידי pipeting איטי.
- להשהות מחדש את גלולת התא ב 8 μL של PBS סטרילי לכל עכבר.
הערה: זהו צעד קריטי.
- מדוד את נפח תרחיף התא באמצעות מיקרופיפטה. במידת הצורך, מוסיפים PBS סטרילי (20 x 106 תאים ב 15 μL של PBS למנה) ומערבבים בזהירות.
- בדוק, באמצעות מיקרופיפטה, כי הנפח הסופי לכל עכבר הוא בין 15 ל 20 μL (הכרחי < 20 μL).
- שמור את התאים על קרח עד הזרקה סטריאוטקטית.
הערה: יותר מ-3 שעות לא נבדקו.
3. הזרקה סטריאוטקטית
- הגדרת ציוד
- להרכיב ולכייל מסגרת סטריאוטקטית של בעלי חיים קטנים בהתאם להוראות היצרן כדי להבטיח את דיוק ההזרקות התוך גולגולתיות (למשל, גודל המזרק, הנפח הרצוי וקצב ההזרקה).
הערה: מומלץ קצב עירוי איטי (כלומר, 2 - 3 מיקרוליטר לדקה).
- התקן את החומר תחת ארון בטיחות מיקרוביאלי (MSC) כדי לשמור על סטריליות המכשירים ולהגן על העכברים מפני זיהומים.
הערה: מניחים "גושים איזותרמיים" באמבט מים ב 37 °C (77 °F). מערכת זו מגבילה את ההיפותרמיה של עכברים במהלך הניתוח. יש להשתמש בכריות חימום, הנחוצות לטיפול פוסט-פרוצדורלי, במהלך ניטור הטמפרטורה הרציף.
- הכנת בעלי חיים לפני הניתוח
- להרדים עכבר עם הזרקה intraperitoneal של קטמין (10 מ"ג / מ"ל) ו xylazine (0.1 מ"ג / מ"ל) ב 10 μL / g של משקל הגוף של העכבר.
- בצע בדיקת צביטת בוהן כדי להבטיח הרדמה מלאה ושיכוך כאבים של החיה.
הערה: כל תנועה היא אינדיקציה לשיכוך כאבים לא עמוק, ואם זה קורה, נדרשות עוד כמה דקות לפני שחוזרים על הניתוח.
- לאחר שהעכבר מורדם כראוי, השתמש במספריים כדי להסיר את הפרווה מאתר הניתוח (בין שתי האוזניים, עד האף).
- הכנת תאים לפני הניתוח
- בזהירות להשהות את התאים עם פיפטה (מספר פעמים) לפני כל הזרקה כדי למנוע כל גושי התא.
- בזהירות למשוך את נפח השעיית התא הנדרש (15 - 20 μL) לתוך microsyringe 22-G כדי למנוע את השאיפה של bubbles.
הערה: שלב העמסת תאים זה לתוך המיקרומזרק חשוב כדי למזער את השונות בנפחים המוזרקים. טען מחדש תאים עבור כל זריקה בודדת בין הליכים כדי למנוע גושי תאים כלשהם ולהבטיח מספר זוגי של תאי השפעה בקבוצה.
- לאחר מכן, הכניסו את המזרק למשאבת המזרק המותאמת.
- טיפול פרוצדורלי
- יש לחטא את אתר הניתוח במקלונים ספוגים בתמיסת פובידון-יוד 5% לפחות פי 3.
- הניחו משחת עיניים מסככת בעיני העכבר כדי למנוע התייבשות של הקרניות.
- מקם את העכבר המרדים על המסגרת הסטריאוטקטית, על בלוק איזותרמי חם מכוסה בניילון נצמד סטרילי כדי לשמור על טמפרטורת העכבר במהלך הניתוח ולהגביל את התמותה.
הערה: האף והשיניים של העכבר צריכים להיות ממוקמים כראוי מעל מוט השן, כדי להבטיח זרימת נשימה נאותה במהלך ההליך.
- ברגע שהעכבר ממוקם מעל מוט השן, הדקו את מוטות האוזניים בחוזקה מתחת לאוזני העכבר כדי לשתק את הראש.
הערה: יש להיזהר שלא לפגוע בעור התוף או לפגוע בנשימה.
- בצע חתך עור sagittal קו אמצע 1 - 2 ס"מ עם מספריים סטריליים לאורך החלק העליון של הגולגולת מן הקדמי האחורי כדי לחשוף את הגולגולת.
- זהו את ההצטלבות של התפרים הסגיטליים והעטרתיים (Bregma) כדי לשמש ציוני דרך ללוקליזציה סטריאוטקטית לפני ההזרקה (מוצג באיור 1).
- מניחים את המיקרומזרק מעל נקודה זו.
- הזז את microsyringe 2 מ"מ ימין לרוחב 0.5 מ"מ קדמי של ברגמה.
- באמצעות מיקרו-מקדחה, עשו חור קטן בגולגולת עם מקדח סטרילי בקואורדינטות קבועות מראש. היזהר להישאר שטחי על מנת למנוע כל פגיעה טראומטית של המוח.
הערה: בפרוטוקול זה הוזרקו תאי מערכת החיסון בתוך גידול מבוסס (שבוע לאחר הזרקת תאי הגידול). יש לפתוח מחדש את העור (צלקת) וההזרקה מבוצעת באותן קואורדינטות המשמשות להשתלת תאי הגידול (החור בדרך כלל עדיין קיים עד שבועיים לאחר ההזרקה). נבחרו קואורדינטות להזרקת תאי גידול והשפעה בפרנכימה במוח.
- הזרקת תאי השפעה חיסונית
- הכנס בזהירות את המיקרומזרק לתוך החור שנקדח, ונע לאט, קדימה את המחט 3 מ"מ למטה בדורה ולאחר מכן אחורה 0.5 מ"מ לעומק סופי של 2.5 מ"מ לפני הזרקת תאי האפקטורים.
- הפעל את הזרקת תאי האפקט במהירות של 2 - 3 מיקרוליטר לדקה ועקוב אחר העכברים לאורך כל זמן ההזרקה.
- לאחר השלמת ההזרקה, משוך את המחט למשך 1 מ"מ בלבד ושמור את המיקרומזרק במקומו למשך דקה נוספת לפני שתמשוך לאט לחלוטין את המזרק, כדי למנוע דליפה מאתר העירוי.
הערה: לאחר הוצאת החיה מהמכשיר הסטריאוטקטי, נקו מיד את ציוד ההזרקה לקראת הניסויים הקרובים.
- טיפול לאחר הניתוח ומעקב אחר עכבר
- הסר את בעל החיים מהמסגרת הסטריאוטקטית ומרח מיד תמיסת פובידון-יוד 5% על אתר החתך וסגור את העור בתפר כירורגי מתאים.
- יש למרוח 2% לידוקאין ג'ל ישירות על הפצע ולתת 0.15 מיקרוגרם/גרם של בופרנורפין על ידי זריקה תת עורית לשיכוך כאבים פוסט-פרוצדורלי.
- החזירו את העכבר המורדם לכלוב שלו מעל כרית חימום המוגדרת לטמפרטורה של 37°C כדי לשמור על טמפרטורת גוף מתאימה של העכבר וכדי למנוע היפותרמיה.
הערה: דיור נפרד אינו הכרחי.
- עקוב אחר העכבר עד שהוא מתאושש לחלוטין מהרדמה והעבר אותו לחדר דיור.
הערה: נכון להיום, פרוטוקול זה נתמך היטב מכיוון שמעט סיבוכים בלתי צפויים התרחשו (< -5% מהעכברים שהוזרקו).
- עקבו מדי יום אחר העכברים והרדימו אותם כאשר נצפים סימנים בריאותיים מתדרדרים (למשל, יציבה כפופה, ניידות מופחתת, השתטחות או ירידה משמעותית במשקל הגוף [≥ 15%]).
