שינוי גנטי של תאי CAR T באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

תקציר

מקור: Sterner, R. M. et al., שימוש בקריספר/Cas9 כדי לדפוק GM-CSF בתאי CAR-T.J. Vis. Exp. (2019)

הסרטון מתאר תהליך ליצירת תאי CAR T מהונדסים גנטית באמצעות מערכת CRISPR-Cas9. הדבקת תאי T ב-CRISPR וב-CAR lentiviruses גורמת לשינויים בגן המטרה ולסינתזה של קולטן אנטיגן כימרי או CAR, מה שמוביל בסופו של דבר להיווצרות תאי CAR T מהונדסים גנטית.

פרוטוקול

1. ייצור תאי CART19

1. בידוד, גירוי ותרבית ex-vivo של תאי T
   1. לבצע את כל עבודות תרבית התאים במכסה מנוע של תרבית תאים תוך שימוש בציוד מגן אישי מתאים. קציר תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מדוכי דם נורמליים של תורמים שהוסרו מהם הזיהוי שנאספו במהלך אפרזיס, שכן אלה ידועים כמקור בר-קיימא של PBMCs.
   2. כדי לבודד PBMCs, הוסף 15 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות לצינור הפרדת שיפוע צפיפות של 50 מ"ל. יש לדלל את הדם התורם בנפח שווה של מלח חוצץ פוספט (PBS) המכיל 2% נסיוב בקר עוברי (FBS) כדי למנוע לכידה של תאים.
      1. מוסיפים את הדם התורם המדולל מהחרוט לתוך צינור ההפרדה, נזהרים שלא להפריע לממשק בין הדם למדיום שיפוע הצפיפות. צנטריפוגה במהירות 1,200 x גרם למשך 10 דקות ב-RT.
      2. דקרו את הסופרנאטנט לחרוט חדש של 50 מ"ל, שטפו עם PBS + 2% FBS על ידי הבאת עד 40 מ"ל, צנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 8 דקות ב- RT, שאפו סופרנטנט, השהו מחדש ב 40 מ"ל חיץ וספרו תאים.
   3. בודד תאי T ממרכזיות PBMC באמצעות ערכת חרוזים מגנטית לבחירה שלילית באמצעות מפריד תאים אוטומטי לחלוטין בהתאם לפרוטוקול היצרן.
   4. כדי לגדל את תאי ה-T המבודדים, הכינו מדיום של תאי T (TCM) המורכב מ-10% סרום AB אנושי (v/v), 1% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (v/v) ותווך תאים המטופויטיים ללא סרום. לעקר את המדיום על ידי סינון דרך מסנן ואקום סטרילי 0.45 מיקרומטר ולאחר מכן עם מסנן ואקום סטרילי 0.22 מיקרומטר.
   5. ביום 0 (יום הגירוי של תאי T), שטפו חרוזי CD3/CD28 לפני גירוי תאי T. כדי לשטוף, מקם את נפח החרוזים הנדרש (השתמש במספיק חרוזי CD3/CD28 ליחס של 3:1 חרוזים:תאי T; הערה: ריכוז החרוזים יכול להיות משתנה) בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל והשהיה מחדש ב -1 מ"ל של TCM.
   6. יש ליצור קשר עם מגנט.
   7. לאחר דקה אחת, שאפו את ה-TCM והשהו מחדש ב-1 מ"ל של TCM טרי כדי לשטוף את החרוזים.
   8. חזור על הליך זה במשך שלוש שטיפות בסך הכל.
   9. לאחר הכביסה השלישית, להשעות את החרוזים ב 1 מ"ל של TCM.
   10. ספור את תאי ה- T.
   11. העברת חרוזים לתאי T ביחס של 3:1 חרוזים:תאים.
   12. לדלל תאים לריכוז סופי של 1 x 10⁶ תאים/מ"ל.
   13. יש לדגור ב-37°C, 5% CO₂ למשך 24 שעות.
2. טרנספקציה והתמרת תאי T
   1. בצע עבודה לנטיויראלית תוך שימוש באמצעי זהירות BSL-2+, כולל ברדסים לתרבית תאים, ציוד מגן אישי וחיטוי חומרים משומשים עם אקונומיקה לפני השלכה.
   2. לרכוש קולטן אנטיגן כימרי-T19 (CART19) מבנה וקטור lentiviral.
      הערה: מבנה CART19 המשמש כאן תוכנן ולאחר מכן סונתז דה נובו באמצעות ספק סינתזת חלבונים זמין מסחרית. מבנה המכונית שוכפל לאחר מכן ללנטיוירוס מהדור השלישי תחת שליטה של מקדם EF-1α. מקטע האזור משתנה השרשרת היחיד נגזר משיבוט FMC63 ומזהה CD19 אנושי. מבנה CAR19 הוא בעל דור שני של 4-1BB וגירוי CD3ζ (FMC63-41BBz).
   3. לבצע ייצור lentiviral כפי שתואר לעיל.
      1. בקצרה, כדי לייצר לנטיוירוס, השתמשו בתאי 293T שהגיעו למפגש של 70-90%.
      2. אפשר דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר של ריאגנטים טרנספקציה כולל 15 מיקרוגרם של פלסמיד לנטיויראלי של עניין, 18 מיקרוגרם של וקטור אריזה gag/pol/tat/rev, 7 מיקרוגרם של וקטור מעטפת VSV-G, 111 μL של מגיב pre-complexing, 129 μL של מגיב transfection, ו 9.0 מ"ל של תווך transfection לפני הוספה לתאי 293T. ואז תרבית את התאים הנגועים ב 37 ° C, 5% CO₂.
      3. קציר, צנטריפוגה (900 x גרם למשך 10 דקות), מסנן (מסנן ניילון 0.45 מיקרומטר) ורכז supernatant ב 24 ו 48 שעות על ידי אולטרה צנטריפוגה ב 13,028 x גרם במשך 18 שעות או 112,700 x גרם במשך 2 שעות.
      4. יש להקפיא בטמפרטורה של -80°C לשימוש עתידי.
   4. ביום 1, השהה מחדש בעדינות תאי T כדי לפרק את הרוזטות של תאי T שעוררו ב 1 x 10⁶/mL ביום 0.
   5. תחת אמצעי זהירות מתאימים של BSL-2+ לכל עבודה לנטי-ויראלית, הוסף וירוס טרי או קפוא שנקטף לתאי T המגורה בריבוי זיהומים (MOI) של 3.0.
3. הרחבת תאי T לרכב
   1. במהלך שלב ההתפשטות, המשך לדגור על תאי T מותמרים ב 37 ° C, 5% CO₂. ספרו תאי CAR T בימים 3 ו-5, והוסיפו TCM טרי שחומם מראש לתרבית כדי לשמור על ריכוז תאי CAR T של 1 x 10⁶/mL.
   2. הסר חרוזים מתאי T המומרים 6 ימים לאחר הגירוי (יום 6) באמצעות מגנט. קצור, השהה מחדש ומקם תאי T בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל במגנט למשך דקה אחת. לאחר מכן אספו את הסופרנאטנט (מכיל את תאי ה-CAR T), והשליכו את החרוזים.
   3. הניחו את תאי ה-CAR T שנאספו בחזרה בתרבית בריכוז של 1 x 10⁶ תאים/מ"ל כדי לחדש את ההתרחבות.
   4. ביום 6, הערך את ביטוי פני השטח של CAR על ידי ציטומטריית זרימה.
      הערה: ניתן להשתמש במספר שיטות כדי לזהות את ביטוי פני השטח של CAR, כגון צביעה עם נוגדן משני מסוג IgG (H+L) נגד עכבר עז (H+L) או על ידי צביעה בפפטיד ספציפי CD19, מצומד לפלואורוכרום. כאן, קחו אליקוט (כ-100,000 תאי T) מהתרבית ושטפו עם חיץ זרימה שהוכן עם מלח חוצץ פוספט של דולבקו, סרום בקר עוברי 2% ונתרן אזיד 1%. מכתימים את התאים בנוגדן נגד CAR ושוטפים פעמיים. לצבוע את התאים עם כתם חי/מת ונוגדן חד שבטי CD3 (OKT3). שטפו את התאים והשהו מחדש במאגר זרימה. לרכוש על ציטומטר כדי לקבוע יעילות התמירה.
4. שימור בהקפאה של תאי T לרכב
   1. כדי לקצור ולשמר בהקפאה תאי CAR T 8 ימים לאחר הגירוי (יום 8 של התרחבות תאי T), קצרו את התאים מהתרבית.
   2. סובב כלפי מטה במשך 5 דקות ב 300 x גרם.
   3. יש להשהות מחדש בתווך הקפאה ב-10 מיליון תאים למ"ל לבקבוקון בתווך הקפאה המורכב מ-10% דימתיל סולפוקסיד ו-90% נסיוב בקר עוברי.
   4. יש להקפיא במיכל הקפאה כדי להשיג קצב קירור של -1°C/min במקפיא של -80°C ולאחר מכן להעביר לחנקן נוזלי לאחר 48 שעות.
   5. לפני השימוש בהם לניסויים במבחנה או in vivo, הפשירו תאי CAR T ב-TCM חם.
   6. לשטוף את התאים כדי לדלל ולהסיר את dimethyl sulfoxide ו resuspend לריכוז של 2 x 10⁶ תאים / מ"ל ב TCM חם. לנוח לילה ב 37 °C (75 °F), 5% CO₂.

2. גרנולוציטים גורם מגרה מושבת מקרופאגים (GM-CSF ^k/o) ייצור CART19

1. כדי לשבש את GM-CSF, השתמש ב-RNA מנחה (gRNA) המכוון לאקסון 3 של GM-CSF אנושי (CSF2) שנבחר באמצעות סינון gRNA שדווח בעבר כבעל יעילות גבוהה עבור הגן CSF2 המקודד עבור הציטוקין האנושי GM-CSF.
   הערה: נעשה שימוש במבנה לנטי-ויראלי מהדור השלישי Cas9 המסונתז מסחרית המכיל gRNA זה (תחת מקדם U6). המבנה מכיל גן עמידות לפורומיצין. הרצף של gRNA הוא GACCTGCCTACAGACCCGCC.
2. כדי לייצר לנטיוירוס, השתמשו בתאי 293T שהגיעו למפגש של 70-90%.
3. אפשר 15 מיקרוגרם של פלסמיד לנטיויראלי של עניין, 18 מיקרוגרם של וקטור אריזה gag/pol/tat/rev, 7 מיקרוגרם של וקטור מעטפת VSV-G, 111 μL של מגיב pre-complexing, 129 μL של מגיב transfection, ו 9.0 מ"ל של תווך transfection לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הוסף ריאגנטים טרנספקציה לתאי 293T. התרבית ב 37 °C (75 °F), 5% פחמן דו חמצני (CO₂).
5. קציר, צנטריפוגה (900 x גרם למשך 10 דקות), מסנן (מסנן ניילון 0.45 מיקרומטר) ורכז supernatant ב 24 ו 48 שעות על ידי אולטרה צנטריפוגה ב 13,028 x גרם במשך 18 שעות או 112,700 x גרם במשך 2 שעות ולהקפיא ב -80 ° C לשימוש עתידי.
6. ביום הראשון, השהה מחדש בעדינות את תאי T כדי לפרק רוזטות.
7. במעבדה מאושרת BSL-2+, הוסף וירוס קפוא או שזה עתה נקטף לתאי T המגורה כדי ליצור תאי CAR T. התמירו תאי T עם CAR19 lentivirus ו-GM-CSF המכוונים ל-CRISPR lentivirus. הוסף CAR19 lentivirus ב MOI של 3. מכיוון שהטיטרציה של CRISPR lentivirus לא הייתה אפשרית, השתמש בחלקיקי וירוס שנוצרו מהכנת פלסמיד 15 מ"ג כדי להתמיר 10 x 10⁶ תאי T.
8. ראה את השלבים הנותרים של גירוי, הרחבה ושימור בהקפאה של תאי T כפי שנדון בשלב 1.
9. עבור תאי T ערוכים של lentiCRISPR הנושאים עמידות לפורומיצין, יש לטפל בתאים עם פורומיצין דיהידרוכלוריד בריכוז של 1 מיקרוגרם של פורומיצין ל-1 מ"ל ביום 3 וביום 5.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נוגדן חד שבטי CD3 (OKT3), PE, eBioscience	Invitrogen	12-0037-42
נוגדן חד שבטי CD3 (UCHT1), APC, eBioscience	Invitrogen	17-0038-42
בחירה Taq Blue Mastermix	דנוויל סיינטיפיק	C775Y51
CTS (מערכות תרפיה תאית) Dynabeads CD3/CD28	גיבקו	40203ד
מערכת CytoFLEX B4-R2-V2	בקמן קולטר	C10343	ציטומטר זרימה
דימתיל סולפוקסיד	מיליפור סיגמא	D2650-100ML
מלח חוצץ פוספט של Dulbecco	גיבקו	14190-144
Dynabeads MPC-S (רכז חלקיקים מגנטיים)	מערכות ביולוגיות יישומיות	A13346
מגנט Easy 50 EasySep	טכנולוגיות STEMCELL	18002
ערכת בידוד תאי T אנושיים EasySep	טכנולוגיות STEMCELL	17951	חרוזים מגנטיים לבחירה שלילית; 17951RF כולל קצוות וחיץ
סרום בקר עוברי	מיליפור סיגמא	F8067
עכבר FITC CD107a אנטי-אנושי	BD Pharmingen	555800
מדיום קיבוע (בינוני A)	Invitrogen	GAS001S100
GenCRISPR gRNA מבנה: שם: CSF2	GenScript	N/A	סדר מותאם אישית
מדריך קריספר RNA 1; מין: אדם, וקטור:
pLentiCRISPR v2; התנגדות: אמפיצילין; מספר העתק:
גבוה; הכנת פלסמיד: משלוח סטנדרטי: 4 מיקרוגרם (חינם
בתשלום)
עז נגד עכבר IgG (H+L) נוגדן משני צולב, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21235
https://tide.nki.nl.	גנטיקה שולחנית
סרום AB אנושי; תורמים גברים; סוג AB; אותנו	קורנינג	35-060-CI
IFN גמא נוגדן חד שבטי (4S. B3), APC-eFluor 780, eBioscience	Invitrogen	47-7319-42
מגיב טרנספקציה Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000075
LIVE/DEAD ערכת צביעת תאים מתים Aqua Dead Cell הניתנת לתיקון, לעירור של 405 ננומטר	Invitrogen	L34966
לימפופר	טכנולוגיות STEMCELL	7851
תמיסת מונסין, 1000X	ביולג'נד	420701
עכבר אנטי אנושי CD28 שיבוט CD28.2	BD Pharmingen	559770
עכבר אנטי אנושי CD49d שיבוט 9F10	BD Pharmingen	561892
עכבר MIP-1β PE-Cy7 נגד אדם	BD Pharmingen	560687
מיכל הקפאה Mr. Frosty	תרמו סיינטיפיק	5100-0001
NALM6, שיבוט G5	ATCC	CRL-3273	קו תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה
מים ללא נוקלאז	פרומגה	P119C
מערכות סינון ואקום אולימפוס, 500 מ"ל, קרום PES, 0.22uM, סטרילי	ג'נסי סיינטיפיק	25-227
מערכות סינון ואקום אולימפוס, 500 מ"ל, קרום PES, 0.45uM, סטרילי	ג'נסי סיינטיפיק	25-228
Opti-MEM I סרום מופחת בינוני (1X), נוזל	גיבקו	31985-070
PE-CF594 עכבר אנטי-אנושי IL-2	אופק BD	562384
פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (100X), נוזלי	גיבקו	10378-016
חדירות בינונית (בינונית B)	Invitrogen	GAS002S100
ערכת מיני DNA גנומי PureLink	Invitrogen	K182001
פורומיצין דיהידרוכלוריד	MP Biomedicals, Inc.	210055210
ערכת מיצוי ג'ל QIAquick	קיאגן	28704
עכברוש נגד אדם GM-CSF BV421	אופק BD	562930
RoboSep-S	טכנולוגיות STEMCELL	21000	מפריד תאים אוטומטי לחלוטין
SepMate-50 (IVD)	טכנולוגיות STEMCELL	85450
נתרן Azide, 5% (w/v)	ריקה כימיקלים	7144.8-16
X-VIVO 15 תא המטופויטי ללא סרום בינוני	לונזה	04-418Q