טכניקת CRISPR-Cas9 לעריכת גנים בתאי T

תקציר

מקור: Agarwal, S., et al. ייצור תאי CAR-T אנושיים מהונדסים CRISPR. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים בדיקה לביצוע עריכת גנים בתאי T אנושיים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. תערובת של תאי T ראשוניים CD4+ ו- CD8+ משולבת עם קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9, המכוון לגנים ספציפיים לנוקאאוט. לאחר ההתחשמלות, ה-sgRNA מנחה את Cas9 לרצף הדנ"א של המטרה, ויוצר חתכים מדויקים. חתכים אלה מתוקנים לאחר מכן על ידי מנגנון חיבור הקצה הלא הומולוגי של התא, המוביל לנוקאאוט גנטי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. תכנון sgRNA ושיבוש גנים בתאי T אנושיים ראשוניים

1. תכנון CRISPR sgRNA's
   הערה: מספר שרתים ותוכניות מאפשרים תכנון של RNA מדריך יחיד (sgRNA) ספציפי למטרה. בפרוטוקול זה, sgRNA של חזרות פלינדרומיות קצרות מקובצות במרווחים קבועים (CRISPR) תוכננו באמצעות CHOPCHOP (https://chopchop.cbu.uib.no), ופורטל תכנון gRNA ממכון ברוד (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).
   1. עבור כל גן מטרה, תכנן שישה עד עשרה רצפי sgRNA כדי להתמקד ברצפי אקסון קידוד מוקדמים.
      הערה: sgRNA צריך להיות בעל יעילות גבוהה על המטרה ויעילות נמוכה מחוץ למטרה. כל אלגוריתם למידת מכונה לקביעת יעילות sgRNA עובד מעט אחרת. לכן, מומלץ להשוות בין כלי תכנון sgRNA מרובים ולאצור רשימה של שישה עד עשרה sgRNA לבדיקה.
2. שיבוש גנים בתאי T אנושיים ראשוניים
   1. השגת תאי דם חד-גרעיניים אוטולוגיים היקפיים (PBMC) מתורמים מתנדבים בריאים. ציר זמן סכמטי של הפרוטוקול מתואר באיור 1A ומתואר להלן.
   2. בודד תאי T מסוג CD4+ ו- CD8+ באמצעות ערכות בחירה CD4 ו- CD8 הזמינות באופן מסחרי.
   3. שלבו תאי T מסוג CD4+ ו-CD8+ ביחס של 1:1 ודגרו במשך הלילה ב-3x10⁶ תאים/מ"ל ב-R10 בתוספת אינטרלוקין-7 אנושי (huIL-7) ואינטרלוקין אנושי -15 (huIL-15) כל אחד. תוספת של IL-7 ו- IL-15 מומלצת מכיוון שהם ידועים כמקדמים פנוטיפ זיכרון מרכזי ותאי קולטן אנטיגן כימרי (CAR)-T המורחבים עם IL-7 ו- IL-15 הם בעלי יעילות גבוהה יותר נגד גידולים בהשוואה לתאי CAR-T מורחבים של אינטרלוקין-2 (IL-2).
   4. למחרת, ספרו תאי T וצנטריפוגה 5-10 x 10⁶ תאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות. השליכו את כל הסופרנאטנט ושטפו את גלולת התא במדיה חיונית מינימלית בסרום. להשעות את הגלולה ב 100 μL של פתרון nucleofection על פי הוראות היצרן (טבלה של חומרים).
   5. בזמן שטיפת התאים, הכינו קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין (RNP) עם חלבון 9 הקשור לקריספר (Cas9) ו-gRNA על ידי דגירה של 10 מיקרוגרם של נוקלאז Cas9 עם 5 מיקרוגרם של sgRNA למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). היחס המולרי של Cas9 ל-sgRNA הוא 1:2.4. בקרת דמה המכילה Cas9 ומשפר אלקטרופורציה, אך ללא sgRNA, מומלצת.
      הערה: בשלב זה ניתן לבצע עריכת גנים מרובים על ידי יצירת קומפלקסים של RNP עבור כל מטרה בנפרד ושילובם עם תאים בזמן הנוקלאופקטציה, כמתואר בשלב הבא. בחירת הריאגנטים להרכבת קומפלקס RNP היא המפתח להשגת יעילות נוקאאוט גבוהה (KO). לדוגמה, לנוקלאזות Cas9 מספקים שונים יש השפעות משתנות מחוץ למטרה, ו-gRNA מהונדס כימית מפחית את הרעילות לתאי T, ובכך מגביר את יעילות KO.
   6. שלב את התאים המרחפים משלב 1.2.4 עם קומפלקס RNP משלב 1.2.5 והוסף 4.2 μL של משפר אלקטרופורציה 4 מיקרומטר (אוליגונוקלאוטיד DNA חד-גדילי [ssDNA] שאינו הומולוגי לגנום האנושי). מערבבים היטב ומעבירים לקוביות אלקטרופורציה. הימנעו מבועות מכיוון שהן פוגעות ביעילות האלקטרופורציה.
   7. תאים אלקטרופורטיים באמצעות קוד פולס EH111. לאחר אלקטרופורציה, תאי הדגירה ב-R10 בתוספת 5 ננוגרם/מ"ל huIL-7 ו-huIL-15 ב-5x10⁶ תאים/מ"ל ב-30°C למשך 48 שעות בלוחות של 12 בארות. לאחר 48 שעות, המשך בהפעלה והרחבה של תאי T.

תוצאות

איור 1. הרחבת תאי CAR-T ערוכים והכפלת אוכלוסייתם. (A) ציר הזמן של עריכה וייצור של CRISPR בתאי CART אנושיים ראשוניים. (B) הכפלות אוכלוסייה בתאי CD19 CAR-T מדומים וערוכי קריספר שנמדדו באמצעות מונה קולטר במהלך הרחבת תאי CAR-T (n=3 תורמים בריאים; KO=knockout) (C) גודל התא (μm3) נמדד באמצעות מונה קולטר במהלך הרחבת תאי CAR-T (n=3 תורמים בר...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
יחידת ליבה 4D-Nucleofactor	לונזה	AAF-1002B
4D-Nucleofactor X-Unit	לונזה	AAF-1002X
Cas9-משפרי אלקטרופורציה	IDT	1075915
ערכת בידוד תאי T CD4+	טכנולוגיות StemCell	15062
ערכת בידוד תאי T CD8+	טכנולוגיות StemCell	15063
קורנינג 0.45 מיקרון מסנן ואקום/בקבוק	קורנינג	430768
בקבוק תרבית תאים קורנינג T150	מיליפור סיגמא	CLS430825
ערכת דם ורקמות DNAeasy	קיאגן	69504
תוסף גלוטמקס	תרמופישר	35050061
HEPES (1 מטר)	תרמופישר	15630080
huIL-15	פפרוטק	200-15
huIL-7	פפרוטק	200-07
ליפופקטמין 2000	תרמופישר	11668019
Opti-MEM	תרמופישר	31985062
P3 תא ראשי 4D-nucleofactor X קיט L	לונזה	V4XP-3024
פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין	תרמופישר	10378016
RPMI1640	תרמופישר	12633012
sgRNA	IDT
מרגלים Fi Cas9	אלדברון	9214