$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. דיור ותחזוקת עכברים
- רכשו עכברי NSG בני 6-8 שבועות (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ).
- אחסן את העכברים בתנאי SPF עם חילופי אוויר, מסננים מקדימים ומסנני אוויר חלקיקי (HEPA) בעלי יעילות גבוהה (0.22 מיקרומטר) בחדר עם טמפרטורה, לחות ולחץ מבוקרים.
- אחסן ותחזק את העכברים בכלובי מיקרואיזולטור בודדים אוטוקלאביים במערכת ארון תקשורת המסוגלת לנהל חילופי אוויר עם מסננים מקדימים ומסנני HEPA (0.22 מיקרומטר).
- בצע את כל ההליכים והמניפולציות של העכברים במכסה מנוע בטיחות ביולוגי Class II Type A2 שטופל מראש באתנול 70%. לפני העבודה בחדר החיות, להתקלח ולהחליף לקרצוף נקי, חליפת Tyvek, כיסויי מגפיים, כובע שיער, מסכת פנים וכפפות. יש ללבוש חלוק ניתוח מעל חליפת Tyvek במהלך הליכים כירורגיים.
הערה: טיהור אור אולטרה סגול (UV) מועדף גם לפני הליכים.
- יש לבצע אוטוקלאבים לכל המכשירים והריאגנטים במידת האפשר, ולאחר מכן לחטא אותם לפני העברתם למכסה המנוע
.
- במהלך הטיפולים, הוציאו את הכלובים המאווררים בנפרד של בעלי החיים מהמדף וחיטאו אותם לפני העברתם למכסה האדים.
- להאכיל את העכברים דיאטה מוקרנת ולספק מים autoclaved. לספק מזון מוקרן ולהשלים עם מזון מוקרן נוסף לפי הצורך. החליפו מים אוטומטיים מדי שבוע או לפי הצורך.
הערה: ניתן להשתמש גם במים חומציים אוטוקלאביים. הדיאטה המוקרנת שסופקה הייתה בעלת חיי מדף של 6 חודשים לאחר הייצור.
2. יצירת עכברי מח עצם, כבד ובלוטת תימוס (BLT) אנושיים
הערה: הדור של עכברי hu-BLT תואר בעבר.
- ביום הניתוח, יש לתת לעכברים הקרנה לכל הגוף במינון של 12 cGy/g ממשקל הגוף.
- הכינו את העכברים לניתוח.
- תן לכל עכבר מוקרן תערובת של קטמין בריכוז עבודה של 100 מ"ג / ק"ג וקסילזין בריכוז של 12 מ"ג / ק"ג, אשר נע בין 130-170 מיקרוליטר לעכבר בהתבסס על משקל הגוף על ידי הזרקה intraperitoneal (IP) להרדמה. להכנת 3 מ"ל מתערובת קטמין וקסילזין, יש להוסיף 0.27 מ"ל קטמין בריכוז מלאי של 100 מ"ג/מ"ל ו-0.03 מ"ל קסילזין בריכוז של 100 מ"ג/מ"ל עד 2.7 מ"ל מלח סטרילי ולערבב היטב. יש לחטא את העור עם 70% איזופרופנול לפני ההזרקה.
- תן לכל עכבר מוקרן בופרנורפין 1 מ"ג / ק"ג של משקל גוף (חצי חי 72 שעות, SR-LAB) על ידי הזרקה תת עורית לניהול כאב לאורך זמן.
- תן לכל עכבר מוקרן 100 μL (858 מיקרוגרם) של Cefazolin על ידי הזרקת IP לטיפול מונע אנטיביוטי לפני הניתוח.
- יש לגלח את שיער העכברים באמצעות קוצצי שיער חשמליים סביב הצד השמאלי הצדדי והמדיאלי של העכבר באתר הניתוח המאוחר יותר המשמש לחשיפת הכליה השמאלית.
- יש לוודא רמת הרדמה נאותה על ידי רפלקס הדוושה (צביטת בוהן קשיחה).
- תן גז איזופלורן ב 3-5% אם יש צורך בהרדמה נוספת בכל שלב במהלך הניתוח.
- החל משחה אופתלמית על שתי העיניים כדי למנוע התייבשות הקרנית. יש למרוח תג אוזניים במידת הצורך.
- בצע ניתוח להשתלת רקמות הכבד והתימוס בכמוסת הכליה השמאלית.
- יש לחטא את העור באתר הניתוח על ידי מריחת פילינג יוד החל ממרכז אתר הניתוח ולנוע כלפי חוץ בצורה מעגלית. חזור על תהליך זה עם 70% איזופרופנול ופעם שלישית עם יוד.
- באמצעות מלקחיים, יש להעמיס תחילה שבר אחד של רקמת כבד עוברית אנושית לתוך טרוקאר. לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, יש להעמיס לתוך הטרוקאר מקטע רקמת תימוס עוברי אנושי אחד. לאחר מכן באמצעות מלקחיים, לטעון עוד שבר רקמת כבד עוברית אנושית לתוך הטרוקאר. רקמות יש לחתוך ל 1-1.6 מ"מ3 כדי להתאים את הממדים הפנימיים של הטרוקאר.
- השתמש במלקחיים כדי להרים את העור והשתמש במספריים כדי לבצע חתך קטן לאורך. הרחב את החיתוך ל 1.5-2 ס"מ בצד שמאל של העכבר.
- השתמש במלקחיים כדי להרים את שכבת השריר והשתמש במספריים כדי לבצע חתך קטן לאורך. האריכו את החתך לפי הצורך כדי לחשוף את הכליה.
- חשוף את הכליה על ידי אחיזה עדינה ברקמת השומן המקיפה את הכליה. אין לגעת ישירות פרנכימה בכליות.
- בצע חתך 1-2 מ"מ בקצה האחורי של קפסולת הכליה באמצעות אזמל.
- מחדירים באיטיות את הטרוקאר הטעון מראש דרך החתך במקביל לציר הארוך של הכליה ומשחררים את הרקמות שבין קפסולת הכליה לכליה.
- בזהירות להחזיר את הכליה ואת המעי למצב הרגיל שלהם. השתמש בתפרים נספגים 5/0 P-3 (P-13) עם מחט 13 מ"מ 3/8 מעגל כדי לסגור את שכבת השריר וסיכות כירורגיות לסגירת העור.
- לאחר הניתוח, הכנס את העכבר לכלוב מיקרואיזולטור אוטוקלאבי נקי להתאוששות.
- כדי למזער את איבוד החום במהלך ההתאוששות שלאחר הניתוח, הניחו את הכלוב המכיל את העכברים על כרית חימום המחוברת למשאבת מים המחממת ומזרימה את המים.
- עקוב אחר העכברים עד שהם חזרו להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבת עצם החזה.
- תוך 6 שעות מסיום הניתוח, דרך וריד הזנב, מזריקים תאי גזע המטופויטיים CD34+ שבודדו מרקמת כבד עוברית אנושית.
- חממו את העכברים עם מנורת חום. יש לחטא את הזנב עם 70% איזופרופנול ולאחר מכן להזריק 1.5 עד 5 × 10 5 תאי גזע / 200 μL לתוך וריד הזנב.
- לעצור כל דימום מההזרקה ולהחזיר עכברים לכלוב המיקרואיזולטור ולכלוב המיקרואיזולטור למתלה הכלוב.
הערה: עכברים לאחר ניתוח שוכנים בדרך כלל יחד, חמישה לכל כלוב מיקרואיזולטור, במהלך ההתאוששות ולאחריה. עם זאת, עכברים שוכנים יחד רק אם כולם עברו ניתוח באותו יום.
- בדוק את העכברים מדי יום. עקוב בקפידה אחר סיכות הניתוח והחלף אותן לפי הצורך. עקוב מקרוב אחר העכברים עבור כל סימן של זיהום או אי נוחות. לספק מזון אוטוקלאבי על רצפת כלוב microisolator במשך כמה ימים לאחר הניתוח.
- יש להסיר את סיכות הניתוח 7-10 ימים לאחר הניתוח. תן גז איזופלורן ב 3-5% כדי להרדים את העכברים. הסר בזהירות את הסיכות ולאחר מכן החל אנטיביוטיקה ומשחה לשיכוך כאבים על האתר.
- אפשר 9-12 שבועות לבנייה מחדש של תאי מערכת החיסון האנושית, ולאחר מכן לאסוף דם היקפי מהווריד הספנוס המדיאלי מכל אחד מהעכברים שהואנשו.
- רסן עכברים מודעים באמצעות ריסון חרוט פלסטיק בגודל מתאים עם פתח ליד ראש העכבר לנשימה ופתח ליד גב העכבר כדי לבודד רגל אחת. הכנס תחילה את העכברים לראש חרוט הריסון ולאחר מכן משוך בעדינות רגל אחת דרך פתח הרגל.
- יש לרסס את הצד המדיאלי של הרגל המבודדת ב-70% איזופרופנול, ולאחר מכן למרוח אנטיביוטיקה ומשחה לשיכוך כאבים על אותו אתר.
הערה: המשחה מסייעת לחשוף את מיקום הווריד ללא צורך בהסרת שיער וכן מסייעת בהיווצרות טיפות דם.
- באמצעות מחט של 25 מד בזווית של 90 מעלות, נקבו את הווריד ואספו 50-100 מיקרוליטר דם באמצעות צינור איסוף דם מצופה חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית (EDTA). עצור את הדימום על ידי הפעלת לחץ על האתר עם גזה סטרילית. לאחר שהדימום נפסק, החזירו את העכברים לכלוב שלהם.
הערה: נפחי הדם המרביים שנאספים הם בדרך כלל 50 μL בשבוע או 100 μL כל שבועיים.
- השתמש בדם ההיקפי שנאסף כדי לבדוק את רמת הבנייה מחדש של תאי החיסון האנושיים באמצעות ציטומטריית זרימה עם נוגדנים עבור hCD45, mCD45, hCD3, hCD4, hCD8, hCD19.
3. טיפול אנטיביוטי
- לפני הטיפול האנטיביוטי, יש לאסוף דגימות צואה לפני הטיפול. העבירו את העכברים לכלוב מיקרואיזולטור אוטוקלאבי חדש.
- הכינו קוקטייל טרי של אנטיביוטיקה רחבת טווח מדי יום.
- הכינו 250 מ"ל מים המכילים מטרונידזול טרי (1 גרם / ליטר), נאומיצין (1 גרם / ליטר), ונקומיצין (0.5 גרם / ליטר) ואמפיצילין (1 גרם / ליטר) עבור כל כלוב מיקרואיזולטור של עכברים.
הערה: השתמש במים אוטוקלאביים או סטריליים עבור מי השתייה בתוספת אנטיביוטיקה.
- הוסף 9.2 גרם של תערובת משקה ממותק סוכר ענבים ל 250 מ"ל של מים בתוספת אנטיביוטיקה.
הערה: השימוש בתערובת משקה ממותק בסוכר ענבים מסווה את טעמה המר של האנטיביוטיקה ומסייע במניעת התייבשות בעכברים.
- החליפו את תערובת המשקה הממותק באנטיביוטיקה ובסוכר ענבים, הוסיפו מים והכניסו את העכברים לכלוב אוטומטי חדש מדי יום.
הערה: עכברים הם קופרופגיים והחלפת הכלובים מדי יום מונעת מהעכברים לחסן את עצמם מחדש בחיידקי מעיים.
- לצריכה מרבית של מיקרוביום המעי דמוי האדם, יש לתת אנטיביוטיקה למשך 14 יום. במהלך הטיפול האנטיביוטי, עקוב אחר העכברים לירידה במשקל והתייבשות. ירידה במשקל צפויה במהלך 3-4 הימים הראשונים ומישורית לאחר מכן למשך הטיפול. אם מתרחשת התייבשות, יש לתת לעכברים תמיסת מלח או רינגרס באמצעות הזרקה תוך צפקית.
הערה: פרוטוקולים אחרים להאנשת מיקרוביום המעי דורשים שימוש פומי באנטיביוטיקה. בעוד שהיא יעילה בפירוק חיידקי המעי המורין, מצאנו כי השיטה הפחות פולשנית של הוספת אנטיביוטיקה למי השתייה הפעילה פחות לחץ על העכברים האנושיים שלנו והובילה לתוצאות טובות יותר.
4. דגימות תורם והשתלת צואה
- הכינו דגימות צואה מתורם אנושי.
- השתמש במקורות מוכנים כראוי של חומר השתלת מיקרוביוטה צואה (FMT) להשתלת צואה בעכברים אנושיים.
- להפשיר תכשירי FMT ו aliquot אותם בתנאים אנאירוביים בתא אנאירובי.
- אם תרצה, בשלב זה ערבב חלקים שווים של דגימות הצואה יחד כדי ליצור דגימה "אנושית" בלתי משוחדת.
- יש להמשיך להקפיא ולהפשיר את חומר ה-FMT למינימום, אם אין צורך בהקפאה או ערבוב של דגימות, יש להפשיר רק מיד לפני ההליך.
- השתלת צואה אנושית
- לאחר השלמת 14 יום של טיפול אנטיביוטי, החליפו את מי השתייה למים אוטוקלאביים והעבירו את העכברים לכלוב אוטוקלאבד חדש. הפסיקו את השינויים היומיים בכלוב ויישמו לוח זמנים לשינוי כלוב אחת לשבוע-שבועיים.
- תן שתי השתלות צואה ב 24 ו 48 שעות לאחר הפסקת אנטיביוטיקה.
- 24 שעות לאחר הטיפול האנטיביוטי, יש להפשיר את הכמות הדרושה של חומר FMT ולתת לכל עכבר 200 מיקרוליטר של חומר FMT דרך הפה. חזור על ההליך שוב לאחר 48 שעות לאחר אנטיביוטיקה.
- יש לפזר כל חומר FMT מופשר שנותר או שאריות על פרוות העכברים שעברו האנשה או על מצע הכלוב.