יצירת חיסון רב-ערכי נגד שלפוחית הממברנה החיצונית

Abstract

מקור: Feng, R., et al. פלטפורמת חיסון ננו-חלקיקים "Plug-and-Display" המבוססת על שלפוחיות קרום חיצוניות המציגות תחום קשירת קולטן SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2022).

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת חיסונים רב-ערכיים נגד שלפוחית הממברנה החיצונית (OMV). תאי יונקים עוברים טרנספורמציה כדי לבטא ולהפריש אנטיגנים נגיפיים המאוחים ל-SpyTag ולתג פוליהיסטידין. אנטיגנים אלה מטוהרים לאחר מכן באמצעות עמודת זיקה של חומצה ניקל-ניטרילוטריאצטית (Ni-NTA). האנטיגן המטוהר מעורבב עם בועיות קרום חיצוניות המבטאות חלבון SpyCatcher (SC) הקשור למשטח. אנטיגנים מרובים נצמדים באופן קוולנטי ל- SpyCatchers באמצעות SpyTags שלהם (ST), ויוצרים OMVs המציגים את האנטיגן, ומשמשים כחיסון רב-ערכי.

Protocol

1. בניית פלסמיד

1. הכניסו רצף SpyCatcher המקודד לדנ"א (איור 1) לתוך פלסמיד pThioHisA-Cytolysin A (ClyA) עמיד לאמפיצילין (ראו טבלת חומרים) בין אתרי BamH I ו-Sal I כדי לבנות את פלסמיד pThioHisA ClyA-SC בעקבות דו"ח שפורסם בעבר.
2. חברו את גן ההיתוך SpyTag-SARS-CoV-2 receptor-binding domain (RBD)-polyhistidine tag (Histag) (איור 1) לתוך פלסמיד pcDNA3.1 (ראו טבלת חומרים) בין אתרי BamH I ו-EcoR I כדי לבנות את הפלסמיד pcDNA3.1 RBD-ST בעקבות דו"ח שפורסם בעבר.

2. הכנת OMV-SC

1. בצע טרנספורמציה של ClyA-SC לפי השלבים הבאים.
   1. יש להוסיף 5 μL של תמיסת פלסמיד pThioHisA ClyA-SC (50 ננוגרם/μL) ל-50 μL של זן BL21 מוכשר, לנשוף בעדינות ולהתקרר על קרח למשך 30 דקות.
   2. מניחים את הפתרון עבור 90 s באמבט המים ב 42 ° C, ולאחר מכן מיד לשים את הפתרון מעורב על קרח במשך 3 דקות.
   3. הוסף 500 μL של Luria-Bertani (LB) בינוני לתרחיף החיידקי, ולאחר ערבוב, תרבית ב 220 סל"ד ב 37 ° C במשך 1 שעה.
   4. צלחת את כל השינוי על צלחת אגר LB המכילה אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל, ראה טבלת חומרים) ותרבית לילה ב 37 ° C.
      הערה: בניסויים הבאים, האמפיצלין נשמר באותו ריכוז בתווך. אם לא, זה עלול לגרום לאובדן פלסמידים בחיידקים.
2. עבור ייצור OMV-SC, בצע את השלבים הבאים.
   1. בודד מושבה בודדת מהצלחת (שלב 2.1.4.) עד 20 מ"ל של LB (עמיד לאמפיצילין) בינוני ותרבית לילה ב-220 סל"ד ב-37°C.
   2. לחסן את התמיסה החיידקית (משלב 2.2.1.) לתוך 2 L בינוני, תרבית ב 220 סל"ד, 37 ° C במשך 5 שעות עד שלב הצמיחה לוגריתמי (OD₆₀₀ננומטר הוא בין 0.6 ל 0.8).
   3. כאשר OD ב 600 ננומטר של הפתרון החיידקי מגיע 0.6-0.8, להוסיף isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG, ראה טבלה של חומרים) כדי להפוך את הריכוז הסופי של הפתרון החיידקי להיות 0.5 mM, ולאחר מכן תרבית לילה ב 220 סל"ד ב 25 ° C.
3. בצע טיהור OMV-SC.
   1. צנטריפוגה את התמיסה החיידקית ב 7,000 x גרם ב 4 ° C במשך 30 דקות.
   2. סננו את הסופרנאטנט עם מסנן קרום של 0.22 מיקרומטר, ולאחר מכן רכזו אותו באמצעות קרום אולטרה-סינון של 100 kD או עמוד סיבים חלולים (ראו טבלת חומרים).
   3. סננו את התרכיז דרך מסנן ממברנה של 0.22 מיקרומטר, ואז צנטריפוגו אותו בטמפרטורה של 150,000 x גרם ב-4°C למשך שעתיים באמצעות אולטרה-צנטריפוגה (ראו טבלת חומרים), והשליכו את הסופרנאטנט עם פיפטה.
   4. להשעות מחדש את המשקעים עם PBS ולאחסן אותו ב -80 °C (80 °F). הפתרון יכול לשמור על יציבות לטווח ארוך ב -80 מעלות צלזיוס.

3. הכנת RBD-ST

1. בצע טרנספקציה RBD-ST לפי השלבים הבאים.
   1. בחר מערכת ביטוי אאוקריוטית מתאימה (למשל, HEK293F) ותגדל את התאים למשך הלילה ב-130 סל"ד ב-37°C לאחר ההתאוששות.
   2. הוסף 20 μL של תמיסת תאים HEK293F למונה התאים האוטומטי (ראה טבלת חומרים), רשום את מספר התאים, התאם את הריכוז ל- 1 x 106 תאים/מ"ל, ולאחר מכן תרבית את התאים בתרבית ב- 130 סל"ד ב- 37 ° C למשך 4 שעות.
   3. מסננים פלסמיד RBD-ST דרך מסנן קרום 0.22 מיקרומטר, ומוסיפים 300 מיקרוגרם פלסמידים למדיום תרבית התא (ראו טבלת חומרים) עד שהנפח הסופי הוא 10 מ"ל; נערו במשך 10 שניות.
   4. יש לחמם פוליאתילנימין (PEI, 1 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) עד 65°C באמבט המים, לערבב 0.7 מ"ל PEI עם 9.3 מ"ל של מדיום תרבית תאים, ולנער לסירוגין במשך 10 s.
      הערה: אל תנערו את הפתרון במרץ. אחרת, הבועות המתקבלות עלולות להשפיע על יעילות הטרנספקציה.
   5. הוסיפו תמיסת פלסמיד לתמיסת PEI, נערו את התערובת לסירוגין במשך 10 שניות ודגרו עליה בטמפרטורה של 37°C למשך 15 דקות.
   6. מוסיפים את התערובת ל 280 מ"ל של מדיום תרבית תאים ותרבית ב 130 סל"ד ב 37 ° C במשך 5 ימים.
2. בצע טיהור RBD-ST.
   1. צנטריפוגה את התאים ב 6,000 x גרם ב 25 ° C במשך 20 דקות ולהשתמש פיפטה כדי לאסוף את supernatant.
   2. מלאו את העמוד ב-2 מ"ל של אגרוז Ni-NTA (ראו טבלת חומרים) ושטפו אותו 3x עם 3x PBS.
   3. הוסף imidazole (ראה טבלה של חומרים) לתוך supernatant התא כדי להפוך את הריכוז הסופי של 20 mM, ולטעון את התא supernatant 2x.
   4. הוסף 3 כרכי עמודות (CV) של PBS המכילים 20 mM של imidazole לכביסה, ואסוף את חלק הכביסה.
   5. elute שיפוע עם 3 CV של PBS המכיל ריכוזים נמוכים עד גבוהים (למשל, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M) של imidazole; elute 2x עבור כל ריכוז.
   6. השתמש ב- SDS-PAGE כדי לזהות את RBD-ST במעברי ריכוז שונים.

4. צימוד ביולוגי וטיהור OMV-RBD

1. קבע את ריכוז החלבון בשיטת בדיקת חומצה ביכונית (BCA) (ראה טבלת חומרים).
   1. לדלל באופן סדרתי את תמיסת החלבון הסטנדרטית אלבומין בסרום בקר (BSA) מ-2 מ"ג/מ"ל ל-0.0625 מ"ג/מ"ל, לדלל את OMV-SC ו-RBD-ST 10x המטוהרים, ולאחר מכן לערבב תמיסות עבודה BCA A ו-B (המסופקות בערכת הבדיקה) ביחס של 50:1 (v/v).
   2. מוסיפים תמיסת חלבון מדוללת (25 מיקרוליטר/באר) ומערבבים עם תמיסת עבודה BCA (200 מיקרוליטר/באר); דוגרים ב-37°C למשך 30 דקות.
   3. למדוד את הספיגה (OD) ב 562 ננומטר של כל באר ולחשב את ריכוז החלבון מן העקומה הסטנדרטית.
2. בצע ביו-צימוד של OMV-SC ו-RBD-ST לפי השלבים הבאים.
   1. ערבבו את OMV-SC ו-RBD-ST ב-PBS ביחס של 40:1 (w/w).
   2. סובבו אנכית כדי למזג את התערובת למשך הלילה ב-15 סל"ד ב-4°C.
      הערה: אנטיגנים שונים עשויים להגיב בפרופורציות שונות. אפשר לנסות יחסי תגובה שונים בהתבסס על מאפייני האנטיגן.

Results

איור 1: רצפי פלסמיד ששימשו במחקר הנוכחי.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
אמפיצלין נתרן	סנגון ביוטק	A610028
מונה תאים אוטומטי	קאונטסטאר	ביוטכנולוגיה
ערכת כימות חלבוני BCA	CWBIO	CW0014S
מכשיר אלקטרופורזה	קאבוי	כוח BV
צנטריפוגת הקפאה במהירות גבוהה	ביורידג'	H2500R
עכבר His-Tag mAb	טכנולוגיית איתות תאי	2366 שניות
אימידזול	סנגון ביוטק	A600277
איזופרופיל בטא-D-thiogalactopyranoside	סנגון ביוטק	A600118
Ni-NTA His-Bind Superflow	קיאגן	70691
OPM-293 מדיום תרבית תאים	מדעי הביולוגיה של Opm	81075-001
פלסמיד pcDNA3.1 RBD-ST	ווהאן Genecreat טכנולוגיה ביולוגית
חיץ פוספט מלוחים	ZSGB-bio	ZLI-9061
פוליאתילנימין ליניארי	מדעי הפולי	23966-1
סולם חלבונים מוחזק	תרמו	26616
pThioHisA פלסמיד ClyA-SC	ווהאן Genecreat טכנולוגיה ביולוגית
מערכות ספסל Quixstand (עמוד סיבים חלול 100 kD)	GE שירותי בריאות
מאגר טעינת SDS-PAGE (5x)	ביוטיים	P0015
נתרן כלורי	סנגון ביוטק	A100241
מכשיר השעיה	טכנולוגיית חיים	מערבל הולה
טריפטון	אוקסואיד	LP0042B
אולטרה-צנטריפוגה	בקמן קולטר	XPN-100
ספקטרופוטומטר אולטרה סגול	היטאצ'י	U-3900
תמצית שמרים	סנגון ביוטק	A610961