$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת מלאי גליצרול מכומת של Bacillus Calmette-Guerin (BCG) דנית ושחפת מיקובקטריום H37Rv
הערה: כל הפרוטוקולים המתוארים בוצעו בתנאי רמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL3).
- הפשירו מלאי גליצרול קפוא של זני BCG דני או H37Rv וחסנו 100 μl ב-10 מ"ל של 7H9 בינוני בתוספת Tween-80 0.05% (v/v) ו-ADC (אלבומין, דקסטרוז, קטלאז) 10% (v/v).
- יש לדגור בתנאים סטטיים במשך שבוע בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהתרבית נמצאת בשלב הגידול.
- להגדיל את תרבית החיידקים על ידי העברת תרבית 10 מ"ל ל 200 מ"ל של מדיום טרי. יש לדגור במשך 20 ימים נוספים בתנאים סטטיים.
- מעבירים לצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל וצנטריפוגות למשך 15 דקות במהירות 2500 x גרם.
- יש להשליך סופרנאטנטים ולהשהות מחדש את כדורית החיידקים בנפח השיורי. מוסיפים חרוזי זכוכית סטריליים בקוטר 3 מ"מ לכל צינור (10 - 15 לכל צינור).
- מערבלים במרץ במשך דקה אחת על מנת לנתק גושי חיידקים. יש להשהות כל גלולה ב-10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) עם Tween-80 0.05% (v/v).
- השאירו את הצינורות למשך 10 דקות ואפשרו לצברי החיידקים וחרוזי הזכוכית הגדולים ביותר לשקוע.
- לשחזר 9.5 מ"ל של supernatant מכל אחד 4 צינורות המכילים גושים קטנים חיידקים בודדים ולהעביר נפחים לצינור צנטריפוגה טרי אחד 50 מ"ל (נפח סופי התאושש 38 מ"ל). צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 400 x גרם.
- יש לשחזר 35 מ"ל של סופרנאטנט (המכיל בעיקר חיידקים בודדים) בצינור צנטריפוגה טרי אחד של 50 מ"ל ולהוסיף 15 מ"ל של PBS עם גליצרול 50% (v/v), ולקבל ריכוז גליצרול סופי של 15% (v/v).
- מערבבים בעדינות ומפיצים ב 1 מ"ל aliquots בצינורות המתאימים להקפאה. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C (פריט אחד מספק כ-50 אליציטוטים של מלאי גליצרול).
- כדי לכמת את מלאי הגליצרול, יש להפשיר גליצרול יום לאחר ההקפאה ולבצע שבע דילולים סדרתיים של פי עשרה בצינורות נפרדים של 1.5 מ"ל המכילים 900 מיקרוליטר PBS.
- צלחת 100 μl של כל דילול בתווך אגר מוצק 7H10 בתוספת ADC 10% (v/v) מוכן בצלחות פטרי בקוטר 55 מ"מ.
- מוסיפים בזהירות חרוזי זכוכית בקוטר 3 מ"מ (כ-10 לצלחת) ומנערים בעדינות את הצלחת כדי לפזר נפח שווה על צלחת האגר. השליכו חרוזים ואטמו את צלחת האגר בפרפילם.
- יש לדגור במשך 21 יום בטמפרטורה של 37°C ולקבוע את ריכוז החיידקים על ידי ספירת יחידות יוצרות מושבה (CFU) בדילולים שבהם ניתן להבחין במדויק בין מושבות בודדות.
2. חיסון עכברים
- הפשירו גליצרול BCG מכומת מראש ודללו אותו ב-PBS להכנת שני תרחיפים. חישוב נפח סופי בהתחשב במינון לכל חיה הוא 100 μl עבור ניהול תת עורי (10,7 CFU לכל מ"ל עבור חיסון תת עורי) ו 40 μl עבור מתן intranasal (2.5 x 10,7 CFU עבור חיסון intranasal).
- השתמש בתחנת עבודה מיוחדת להרדמה עבור מכרסמים כדי להרדים עכברים עם תערובת של isoflurane וחמצן. השתמש isoflurane 5% כדי לגרום להרדמה ו 2% כדי לשמור על העכברים בחדר ההרדמה. (ניתן להשתמש בשיטת הרדמה מקובלת אחרת).
- למתן חיסון תת עורי מלא מזרק 1 מ"ל עם מחט 26 גרם עם 1 מ"ל של תרחיף חיידקי (107 CFU/ml). הסירו בועות אוויר.
- הניחו עכבר מורדם על משטח שטוח במצב נוטה בתוך מכסה מנוע זרימה למינרית וחסנו תת עורית 100 μl (10,6 CFU/dose) של חיסון באגף של גב העכבר. החזירו את העכבר לכלוב ועקבו אחריו כדי לוודא שהוא מתאושש כראוי מההרדמה.
- שנה את מחט המזרק בין כל ניהול עכבר. הוסרו בועות אוויר כמתואר לעיל.
- למתן תוך אף, הניחו עכבר מורדם במצב שכיבה בתוך מכסה המנוע.
- עם מיקרופיפטה לקחת 20 μl של המתלה עם 2.5 x 107 CFU/ml. מניחים את החיסון טיפה אחר טיפה בין שני הנחיריים עד שכל הנפח שוקע, ומשאירים זמן בין טיפות כדי לאפשר לעכבר לנשום את עוצמת הקול פנימה.
הערה: עכברים עלולים לסבול ממצוקה נשימתית במהלך הליך זה ולכן יש להשאיר אותם להטמיע כל טיפה לפני מתן הטיפה הבאה כדי למנוע אותה ככל האפשר.
- ממלאים מחדש את המיקרופיפטה בעוד 20 μl וחוזרים על הפעולה. אם העכבר מתחיל להתעורר מההרדמה לאחר החיסון הראשון, הניחו אותו בחדר ההרדמה לפני החיסון השני. החזירו את העכבר לכלוב וודאו שהוא מתאושש כראוי מההרדמה.
3. אתגר תוך אפי עכבר עם זן H37Rv
- הפשירו גליצרול H37Rv מכומת מראש ודללו אותו ב-PBS כדי להכין תרחיף חיידקי של 2,500 CFU למ"ל. חשב נפח סופי בהתחשב בכך שהמינון לכל חיה הוא 40 מיקרוליטר.
- H37Rv מחוסן תוך אפית כמתואר ב 2.5 - 2.7. מינון האתגר הסופי לעכבר הוא 102 CFU/40 μl.