$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת החומר
הערה: הניתוח מתבצע בתנאים אספטיים. לפני שמתחילים, יש לוודא שכל כלי הניתוח, כולל המקדחים, מנוקים באמצעות חומר חיטוי מתאים.
- הכינו תערובת הרדמה: 0.02 מ"ג/מ"ל פנטניל, 0.4 מ"ג/מ"ל מידזולם ו-0.2 מ"ג/מ"ל מדטומידין (ריכוזים סופיים בתערובת).
הערה: עיין בסעיף הדיון המתאים לקבלת חומרי הרדמה חלופיים.
- הכינו תערובת נוגדנים: 0.07 מ"ג / מ"ל של flumazenil ו 0.42 מ"ג / מ"ל של atipamezole (ריכוזים סופיים בתערובת).
- הרכיבו את הצנתר ואת מכסה הצנתר עם הכניסה והבורג. חתכו את הצנתר לאורך של 2 מ"מ בעזרת אזמל (איור 1).
הערה: אין להשתמש במספריים לשם כך מכיוון שהם לוחצים ומעוותים את צורת החתך המעגלית של קצה הצנתר.
2. הכנה כירורגית
- מרדימים את החולדה על ידי מתן intraperitoneal של תערובת הרדמה (1.5 מ"ל / ק"ג של משקל הגוף).
- מגלחים את ראש החולדה בין האוזניים באמצעות מכונת הגילוח החשמלית. הניחו שמיכה הומאורמית על המסגרת הסטריאוטקטית לפני מיקום החיה, כדי למנוע היפותרמיה לאורך כל הניתוח.
- יש לשתק את ראש החולדה במסגרת הסטריאוטקטית באמצעות מוטות האוזניים וצלחת הנשיכה, ולהבטיח שהראש אופקי ויציב. בדוק את היציבות על ידי הפעלת לחץ על הגולגולת עם אצבע או מלקחיים.
הערה: קיבוע רופף ומיקום לא אופקי בתוך המסגרת הסטריאוטקטית עלולים לגרום לסטייה מהקואורדינטות המיועדות.
- יש למרוח טיפות עיניים מסככות למניעת יובש בקרנית במהלך הניתוח. יש לכסות את העיניים בחומר אטום כדי למנוע חשיפה כירורגית לאור.
- נקה את האזור המגולח על ידי יישום לסירוגין של 70% אתנול ו 10% povidone-יוד מורכב.
הערה: יש לנקוט בכל אמצעי הזהירות במהלך הניתוח כדי למנוע זיהום. הניתוח מתבצע בתנאים אספטיים. אם אספסיס נשבר, אז החומר המזוהם צריך להיות מוחלף.
3. השתלת קטטר
- בצע חתך אורכי באורך של כ -2 ס"מ באמצע עור הראש. השתמש מלחציים בולדוג להחזיק את העור לצדדים. לקבלת מבט כולל על שלבים אלה, ראה איור 2.
- הסר את הדם באמצעות מוליך כותנה.
- הסר את periosteum הגולגולת. נקו את הרקמה עם המוליך בקצה הכותנה וחשפו את עצם הגולגולת. הניחו לגולגולת להתייבש במשך כדקה.
- זהה את ציוני הדרך האנטומיים, Lambda, Bregma, ואת התפר המדיאלי. כאשר המקדחה מותקנת על המסגרת הסטריאוטקטית, מקם את קצה המקדחה בברגמה כנקודת ההתחלה. יש להזיז 2 מ"מ אחורית מהברגמה ולעבור ~2.4 מ"מ לרוחב לתפר המדיאלי.
- קדח חור בקוטר 0.5 מ"מ עבור הצנתר במיקום זה. לנפח בעדינות כל אבק עצמות.
הערה: חשוב שהדורה מאטר יישאר שלם במהלך הקידוח. כדי להבטיח זאת, 1) השתמש במקדחה שניתן להתקין על המסגרת הסטריאוטקטית, 2) בדוק את החור לעתים קרובות במהלך הקידוח, 3) הסתעף בצעדים קטנים. אם מופעל לחץ רב מדי על הגולגולת, קצה המקדחה ימשיך לתוך המוח ויפגע בו כאשר הגולגולת חודרת במלואה.
- קדח 3 חורים נוספים (~ 1.3 מ"מ קוטר) עבור ברגי העוגן במרחק של כמה מילימטרים מהחור הראשון. להעיף בעדינות אבק עצמות.
הערה: בחר מיקומי ברגי עיגון המספקים מספיק מקום לראש הצנתר (~ 2 מ"מ קוטר) ולראשי בורג העוגן (~ 1 מ"מ).
- הסר את אבק העצם על ידי השקיה עם סביב 1 - 2 מ"ל של מלח סטרילי פוספט חוצץ (PBS) או מלוחים פיזיולוגיים באמצעות מזרק. נקו את הגולגולת. הדקו את ברגי העוגן ב 2 - 3 סיבובים מלאים.
הערה: ברגי העוגן נחוצים לייצוב המערך על ידי החזקת המלט הדנטלי ובכך הצנתר במקומו. בעת הידוק בורג עוגן, ודא שהוא אינו ניתן להסרה בקלות על ידי הרמתו בעדינות כלפי מעלה עם מלקחיים. מכיוון שהשתלת הצנתר עצמה גורמת לטראומה ברקמות, פגיעה נוספת בדורה בזמן קידוח או הידוק ברגי העוגן תוביל לפציעות טראומטיות מרובות ואולי תפגע ביכולת ההשוואה בתוך קבוצה. הדקו תחילה את ברגי העוגן והכניסו את הצנתר אחרון.
- הכנס את הצנתר באורך 2 מ"מ דרך החור הראשון, בניצב למשטח הגולגולת. בעודכם עדיין מחזיקים את הצנתר בפנים, מרחו מעט מלט דנטלי ותנו לו להתפלמר עם חשיפה קצרה (~ 5 שניות) לאור מרפא השיניים כדי לייצב את הצנתר, מה שמאפשר שימוש בשתי הידיים בשלב הבא.
זהירות: בעת עבודה עם פנס מרפא שיניים, הימנעו מלהסתכל ישירות על הקצה, או על האור המוחזר מאזור היישום, מכיוון שהעוצמה הגבוהה של אור זה עלולה לגרום לנזק לרשתית. השתמש במשקפי מגן מתאימים.
- יש למרוח יותר מלט דנטלי סביב הצנתר, לעגן את הברגים ולמצק את המלט הדנטלי בעזרת אור ריפוי השיניים (~ 15 - 30 שניות). לאשר את התקשות המלט עם קצה של מלקחיים.
4. סגירת הפצע ואנטגוניזם של הרדמה
- סגור את עור הראש עם תפרים הניתנים לספיגה חוזרת, קדמית ואחורית לצנתר.
הערה: מכיוון שתהיה מהמורות מעל הגולגולת בסוף ההשתלה, בצע את סגירת הפצע בהתאם. הרמת העור יותר מדי תגרום לאי נוחות עבור החיה.
- הזריקו את תערובת התרופות באופן תת עורי (1.5 מ"ל/ק"ג משקל גוף) באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 26 גרם.
- מתן אנרופלוקסצין (2.5%) בזריקה תת עורית (7.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) לטיפול אנטיביוטי מניעתי. מתן קרפרופן (1 מ"ג / מ"ל; 5 מ"ג / ק"ג משקל גוף) ובופרנורפין (1.2 מ"ג / ק"ג) להקלה על כאב על ידי הזרקה תת עורית.
5. טיפול תרופתי לאחר הניתוח
- להחזיר את החיה לכלוב שונה ולשמור אותו תחת תצפית במשך 1 - 3 שעות, עם יישום של אור אינפרא אדום כדי למנוע היפותרמיה. כל הזמן להתבונן ולמקם מחדש את החיה כל 5 עד 10 דקות עד התאוששות לאחר הניתוח. יש להקפיד במיוחד להימנע מחשיפה מתמדת לאור העיניים עד להחלמה.
- יש לחזור על מתן אנרופלוקסצין (7.5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקרפרופן (1 מ"ג/מ"ל; 5 מ"ג/ק"ג משקל גוף) על ידי זריקות תת עוריות יום לאחר הניתוח. Buprenorphine אין צורך להיות רענן כמו הטיפול הקודם יעיל במשך 72 שעות.
6. הכנת תערובת חיסונים (לכל המוקדם 14 יום לאחר השתלת קטטר)
הערה: הניחו את המזרקים על קרח במהלך הליך ההכנה.
- חבר שני מזרקי זכוכית קצה מנעול Luer 10 מ"ל לזרועות הקצרות של סטופקוק תלת כיווני וסגור את השקע השלישי עם הזרוע הארוכה.
- ודא שהחיבורים מאובטחים וללא דליפות: הוסף כ -4 מ"ל של PBS סטרילי למזרק הפתוח תוך אחיזת בוכנה 2. הכנס בוכנה 1 ודחוף את שתי הבוכנות קדימה ואחורה תוך בדיקת דליפה. אם לא מתרחשת דליפה, השליכו את PBS והסירו שוב את בוכנה 1.
- פיפטה 1 מ"ל של אדג'ובנט לא שלם של פרוינד (IFA) ו 50 מיקרוגרם של גליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין רקומביננטי (rMOG1-125) יחד ולהתאים את התערובת לנפח סופי של 2 מ"ל עם PBS סטרילי (pH 7.4) בצינור מתאים.
הערה: בשל אובדן תחליב על הקצוות או הקירות של מזרקים במהלך ההכנה, להכין נפח גדול יותר מהמיועד לממשל. זה גם מעשי יותר להתכונן ליותר מחיה אחת בבת אחת.
- מניחים את תערובת IFA ו-rMOG1-125 המדוללת במזרק הפתוח. הכניסו את הבוכנה בעדינות תוך שמירה על לחץ רופף על הבוכנה הנגדית (איור 3A).
- תחליבו את החיסון על-ידי העברתו ממזרק אחד לשני על-ידי דחיפת הבוכנות קדימה ואחורה עד שהוא לבן וצמיג (איור 3B).
- תקנו מזרק נעילת Luer בנפח 1 מ"ל לזרוע הקצרה הפתוחה של הסטופקוק התלת-כיווני ומלאו אותו באינוקולום (איור 3C). להפיץ את כל inoculum מזרקים 1 מ"ל. שמור אותו על קרח עד הזריקה. יש לתת את התערובת ביום ההכנה.
7. חיסון
- מרדימים את החולדה עם איזופלורן בתא (~ 2 דקות, מעורבב עם חמצן 2 ליטר לדקה) ולאחר מכן ממשיכים בהרדמה באמצעות מסכה (מעורבב עם חמצן 1.5 ליטר לדקה).
- הזריקו 200 μL של חיסון תת עורי בבסיס הזנב באמצעות מחט 21 G.
הערה: יש לתת את ההזרקה באיטיות מכיוון שהתמיסה צמיגה.
8. הזרקת ציטוקין תוך מוחי
- התאם את אורך צינורית המחבר (2 מ"מ). (ראו איור 4 לשלבי ההכנה).
- מלאו מזרק 1 מ"ל בתערובת הציטוקינים (500 ננוגרם/מיקרוליטר של גורם נמק גידולי-אלפא (TNF-אלפא), 300 U/μL של אינטרפרון-גמא רקומביננטי של חולדה (IFN-gamma) ב-PBS סטרילי). חבר את המזרק לצינורית מחבר. ממלאים את הצינורית בתערובת הציטוקינים. הימנעו מבועות.
- הרכיבו את המזרק על משאבת המזרק הניתנת לתכנות ותכנתו אותו להזריק 0.2 מיקרוליטר/דקה (איור 5A). הפעל את המשאבה ושמור עליה פועלת על מנת למנוע היווצרות בועות אוויר בקצה הצינורית.
הערה: מהירות ההזרקה חייבת לקחת בחשבון את הקוטר הפנימי של המזרק הספציפי בו נעשה שימוש; לפיכך, יש לרשום את קוטר המזרק במהלך התקנת המשאבה.
- הרדימו את החולדה עם איזופלורן בתא (~2 דקות, מעורבבות עם 2 ליטר/דקה של חמצן) ולאחר מכן המשיכו את ההרדמה באמצעות מסכה (מעורבבת עם 1.5 ליטר/דקה של חמצן) (איורים 5B ו-5C). מרחו טיפות עיניים מסככות מכיוון שהחיה תורדם למשך 30 דקות לפחות.
- הסירו את מכסה הצנתר עם הפתח. הכניסו את צינורית המחבר לצנתר, הבריגו והדקו אותה (איורים 5D ו-5E).
הערה: אין להדק אותו יתר על המידה, מכיוון שזה יהרוס את הקצה העליון של הצנתר.
- אפשר להזרקה להמשיך במשך 10 דקות (נפח ההזרקה הכולל הוא 2 μL). עצור את המשאבה. השאירו את הצינורית בתוך הצנתר למשך 20 דקות כדי לאפשר לנפח המוזרק להתפזר במלואו.
- פתח את צינורית המחבר והסר אותה לאט כדי למנוע אפקט ואקום.
- חברו מחדש את מכסה הצנתר עם הכניסה והבריגו אותו. אפשרו לבעל החיים להתאושש מההרדמה בכלוב.
