יצירת מודל עור פצוע של שחלה Ex Vivo נגוע בפתוגן חיידקי

תקציר

מקור: Regan, H. C., et al. מודל פצע עור חדשני בתפוקה גבוהה Ex Vivo Ovine לבדיקת אנטיביוטיקה מתפתחת. J. Vis. Exp. (2022).

הסרטון מדגים את הדור של דוגמנית עור שחלות ex vivo נגועה בסטפילוקוקוס זהוב. זה כרוך בטיפול בקטע ביופסיית עור המצח של הטלה עם אנטיביוטיקה, הקמת מיטת פצע, הצבתו על קרום חדיר בצלחת מרובת בארות עם מדיום ללא אנטיביוטיקה, וקביעת זיהום חיידקי בפצע העור.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. עיקור

1. יש לחטא את המלקחיים לפני איסוף הראשים על ידי לקיחת מלקחיים נקיים וביצוע עיקור בחום יבש בתנור בטמפרטורה של 200°C למשך שעה אחת. יש לחטא את כל כלי הזכוכית בטמפרטורה של 121°C למשך 15 דקות לפני השימוש.
2. בצע את כל העבודה המתוארת בתוך ארון מיקרוביולוגיה סוג 2. הכינו את כל הריאגנטים בהתאם להוראות היצרן.

2. אוסף דוגמאות

1. בבית המטבחיים, כבשי סוואלדייל נשחטו על ידי הימום באמצעות חשמל או אקדח בריח שבוי והוחרמו. לאסוף ראשי טלה לא יותר מ 4 שעות לאחר השחיטה.

3. הכנת הראשים

1. יש לחטא את אזור המצח של הטלה על ידי שפיכת כ-100 מ"ל של תמיסת כלור דו-חמצני בגודל 200 ppm על אזור הדגימה. לגלח את החלק המצח של הראש באמצעות קוצץ חשמלי ולשטוף את האזור עם 200 מ"ל של 200 ppm כלור דו חמצני פתרון.
2. נגבו את האזור באתנול ובגליל כחול וכסו את אזור הדגימה בקרם להסרת שיער למשך 35 דקות. גרדו בעדינות את הקרם להסרת שיער באמצעות כלי גירוד והעריכו את אזור הדגימה. אם נשארת כמות משמעותית של שיער, חזור על תהליך הסרת השיער.
3. השתמש 200 מ"ל נוספים של תמיסת כלור דו חמצני כדי לשטוף את האזור, ולאחר מכן לשטוף עם אתנול לנגב עם גליל כחול.
4. בעזרת ניקוב ביופסיה סטרילי של 8 מ"מ, חותכים דגימות עור של 8 מ"מ מהאזור המוכן. הסר את הדגימות באמצעות מלקחיים סטריליים ואזמל 15 להבים, וודא שכל השומן העורי מוסר.
5. מניחים את הדגימות בצנצנת סטרילית של 0.5 ליטר מלאה במי מלח סטריליים חוצצים פוספט (PBS), ולאחר מכן מעבירים אותן לצינורות סטריליים של 50 מ"ל עם 50 מ"ל של תמיסת כלור דו-חמצני של 200 ppm, הופכים פעמיים, ומשאירים לעיקור למשך 30 דקות.
6. הסר את הדגימות מתמיסת כלור דו חמצני ושטוף אותם על ידי הצבתם בצינור 50 מ"ל מלא 40 מ"ל של PBS סטרילי. לאחר השטיפה, הניחו כל דגימת עור בנפרד בבאר נפרדת של צלחת בת 24 בארות.
7. הוסף 350 μL של תווך מחומם מראש תוך שמירה על הדגימה בממשק אוויר-נוזל. הרכב המדיה הוא כדלקמן: מדיה MK (בינוני 199 עם מלחי הנקס, L-גלוטמט, ו 1.75 מ"ג / מ"ל סודיום ביקרבונט) ו F12 של Ham ביחס של 1: 1, עם תוספת נסיוב בקר עוברי (FBS, 10% v/v), גורם גדילה אפידרמיס (EGF, 10 ng / mL), אינסולין (5 מיקרוגרם / מ"ל), פניצילין-סטרפטומיצין (100 U / mL), ואמפוטריצין B (2.5 מיקרוגרם/מ"ל).
8. אטמו את הצלחות בנות 24 הבארות עם אטם צלחת חדיר לגז ודגרו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור רקמה לח של 5% CO₂ למשך עד 24 שעות.

4. שמירה על דגימות עור

1. לאחר הדגירה, הסר את מדיום התרבית ושטוף את הדגימות ב 500 μL של מלוחים סטריליים חוצצים פוספט (PBS). הוסף מדיה נטולת אנטיביוטיקה לכל דגימה ודגור בטמפרטורה של 37°C באינקובטור רקמה לח של 5% CO₂ למשך 24 שעות כדי להסיר שאריות אנטיביוטיקה בדגימה.
2. אם עכירות או זיהום פטרייתי מתפתחים בתקשורת ללא אנטיביוטיקה לאחר 24 שעות, יש להשליך את הדגימה.

5. הכנת החיסון

1. הכינו צינור 50 מ"ל עם 10 מ"ל של מרק סויה טריפטי סטרילי. קח צלחת אגר טרי של S. aureus ולהשתמש מטוש להעביר כמה מושבות לתוך המרק. דגירה במשך 18 שעות ב-37°C ב-150 סל"ד.
2. צנטריפוגה ב 4,000 x גרם למשך 3 דקות. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 10 מ"ל של PBS סטרילי. יש לחזור על הפעולה פעמיים כדי להבטיח שטיפה נאותה של התאים.
3. כוונן את החיסון ל- 0.6 OD₆₀₀ ב- PBS סטרילי. אשר את עומס החיסון על ידי ביצוע ספירת צלחות ידנית.

6. זיהום של דגימות עור

1. הכינו צלחת טרייה בת 24 בארות עם 400 מיקרוליטר של מדיה נטולת אנטיביוטיקה שחוממה מראש והוסיפו את 24 הבארות באמצעות מלקחיים סטריליים.
2. הסר את המדיה מדגימות העור, שטוף עם 500 μL של PBS סטרילי, והסר את השטיפה. השתמשו במלקחיים סטריליים כדי להחזיק בעדינות את הדגימה בתחתית הבאר.
3. השתמש בביופסיית ניקוב 4 מ"מ כדי ליצור דש פצע מרכזי, חודר לעומק גס של 1-2 מ"מ. לאחר מכן, השתמש באזמל בעל 15 להבים ומלקחיים סטריליים של רקמת אליס כדי להסיר את השכבה העליונה של דש הפצע. שונות בממדי הפצע עשויה להשפיע על תוצאות הזיהום ועל יחידות יצירת מושבת הקצה (CFU).
4. לאחר שכל הדגימות נפגעו, העבירו אותן ל-24 הקידוחים באמצעות מלקחיים סטריליים. פיפטה 15 μL של החיסון החיידקי לתוך מיטת הפצע. לאחר מכן, לדגור במשך 24 שעות ב 37 ° C באינקובטור רקמות לח 5% CO₂.
5. אם יש צורך בתקופות דגירה ארוכות יותר, הסר את המדיה והחלף אותה במדיה טרייה כל 24 שעות ודגרה באותם תנאים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
24 צלחת נלווית היטב	SLS	353504
ניקוב ביופסיה 4 מ"מ	וויליאמס מדיקל	D7484
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	10788561
ניקוב ביופסיה 8 מ"מ	וויליאמס מדיקל	D7488
תמיסת אמפוטריצין B, סטרילית	סיגמא	A2942
גוזז שיער אלחוטי קולור פרו סטייל	וואהל	9639-2117X	גוזז שיער
אינקובטור תנור כפול	SLS	OVe1020	חיטוי תנור
גורם גדילה אפידרמיס	SLS	E5036-200UG
אתנול	האניוול	458600-2.5 ליטר
F12 חזיר	סיגמא	N4888
סרום בקר עוברי	לאבטק הבינלאומי	CA-115/500
מלקחיים	פישר סיינטיפיק	15307805
קרם להסרת שיער	Veet	לא ישים
Heracell VIOS 160i	תרמו סיינטיפיק	15373212	אינקובטור תרביות רקמה
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	צנטריפוגה
הכנס קרום בודד 24 באר 0.4um	VWR הבינלאומי	353095
אינסולין, רקומביננטי אנושי	SLS	91077C-1G
בינוני 199 (ח"כ מדיה)	סיגמא	M0393
Microplate, תרבית תאים Costar 96 באר	פישר סיינטיפיק	10687551
מולטיטרון	אינפורס	לא ישים	אינקובטור חיידקי
טבליות PBS	סיגמא	P4417-100TAB
פניצילין-סטרפטומיצין	SLS	P0781
אטמי לוחות	פישר סיינטיפיק	ESI-B-100
בטוח 2020	פישר סיינטיפיק	1284804	ארון בטיחות למיקרוביולוגיה סוג II
להב אזמל מספר 15	פישר סיינטיפיק	O305
אזמל סוואן מורטון	פישר סיינטיפיק	11849002
סודיום ביקרבונט	סיגמא	S5761-1KG
מלקחיים רקמת אליס עם שיניים	Rocialle	RSPU500-322
מרק סויה טריפטי	Merck מדעי החיים בריטניה מוגבלת	41298-500G-F
טבליות Vimoba	קוויפ לאבס	VMTAB75BX