טכניקה לעריכת גנים בתאי הרג טבעיים באמצעות CRISPR Cas9

תקציר

מקור: Naeimi Kararoudi, M., et al. Generation of Knock-out של תאי NK אנושיים ראשוניים ומורחבים באמצעות ריבונוקלאופרוטאינים Cas9. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים טכניקה לשינוי גנטי בתיווך ריבונוקלאופרוטאין Cas9 של תאי הרג טבעי ראשוני (NK). ריבונוקלאופרוטאין Cas9, המורכב מאנדונוקלאז Cas9 הקשור ל-RNA מנחה (gRNA) שנוצר על ידי זיווג בסיסים של CRISPR RNA (crRNA) ו-crRNA מפעיל טרנס-מפעיל (tracrRNA), מוחדר לתאי הרג טבעיים ראשוניים באמצעות אלקטרופורציה. הריבונוקלאופרוטאין מכוון ומבקע את ה-DNA המארח באתר המטרה, מה שמוביל לנוקאאוט של הגן באמצעות שינוי גן המטרה באמצעות מכונות תיקון תאים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.

1. טיהור והרחבה של תאי NK אנושיים

1. לבודד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) מ-Buffy Coat.
   1. שכבה 35 מ"ל של דגימת מעיל באפי על 15 מ"ל של Ficoll-Paque.
   2. צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 20 דקות ללא בלם ואוספת את ה-PBMC מהממשק.
   3. שטפו את ה-PBMCs המוחזרים שלוש פעמים על ידי הוספת נפח שווה לפחות של PBS, צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ושאיבת שטיפת ה-PBC. ניתן לבודד את תא NK בשלב זה על ידי RosettesSep.
2. הרחב תאי NK על ידי גירוי עם תאי הזנה המבטאים 10 x 10⁶ mbIL21 מוקרנים בימים 0, 7 ו-14. החלף את המדיה ב-RPMI טרי המכיל 10% FBS, 1% גלוטמין, 1% פניצילין סטרפטומיצין ו-100 יחב"ל/מ"ל של IL-2 עבור כל נפח המדיה אחת ליומיים.

2. עיצוב ובחירה של gRNA

1. בחר את המיקומים הגנומיים הספציפיים למיקוד, באמצעות כלים מקוונים, למשל, NCBI, Ensemble.
   דוגמה.
   תיאור: שינוי גורם גדילה קולטן בטא 2 (TGFBRR2) ectodomain
   צפה ברשומה: PF08917
   צפה ב-InterPro: IPR015013
   מיקום: 49 - 157 aa
   רצף ממוקד: אקסון 4 של הגן TGFBR2 (ENSG00000163513)
2. כדי לעצב את ה-gRNAs, השתמש בכלי אינטרנט לעיצוב CRISPR כגון http://crispr.mit.edu ו-'Benchling'.
   1. הזן את רצף ה-DNA שנבחר בשלב 2.1. בחר אנושי (hg 19) כגנום מטרה. מדריכי CRISPR (20 נוקלאוטידים ואחריהם רצף מוטיב סמוך לפרוטוספייסר (PAM): NGG) ייסרקו מהרצף שהוזן קודם לכן. זה גם מראה התאמות אפשריות מחוץ למטרה בכל הגנום שנבחר.
   2. בחר את שלושת ה-gRNAs הטובים ביותר בעלי הציון הגבוה ביותר, בהתבסס על שיעורי המטרה ומחוץ ליעד שלהם. לדוגמה, טבלה 1 מציגה את ה-CRISPR RNAs המתוכננים כדי למקד לאקסון 4 של הגן TGFBR2 שהוצע על ידי כלי אינטרנט לעיצוב CRISPR.
3. הזמינו את ה-CRISPR RNAs כ-crRNA סינתטיים ספציפיים לרצף.
4. הזמינו RNA משומר וטרנסאקטיבי (tracrRNA) לאינטראקציה באמצעות הומולוגיה חלקית עם ה-crRNA.

3. פריימרים להקרנת מחיקת עיצוב

1. תכנן פריימרים המשתרעים על אתרי מחשוף ה-gRNA לבדיקת מוטציה T7E1.
2. השתמש בפריימרים במרחק של לפחות 100 bp מאתר המחשוף החזוי כדי להבטיח החדרה-מחיקה קטנה (indels) באתר היעד sgRNA תופיע על ג'ל אגרוז של 1.5% לאחר בדיקת המוטציה. טבלה 2 מציגה את הפריימרים המשמשים להגברת האקטודומיין TGFBR2.

4. התמרה של תאי NK ראשוניים ומורחבים אנושיים

הערה: התמרה של אלמנטים Cas9/RNPs ל-NK נעשית על ידי אלקטרופורציה באמצעות מערכת 4D כדלקמן.

1. הכנת תאים
   1. עבור תאי NK ראשוניים, יש לדגור על תאי NK מבודדים טריים במדיום של מכון רוזוול פארק ממוריאל (RPMI) בנוכחות 100 IU/mL של IL-2 למשך 4 ימים ולבצע את האלקטרופורציה ביום 5. החלף את המדיה כל יומיים כפי שתואר קודם לכן ויום לפני ההעברה.
   2. עבור תאי NK מורחבים, עוררו את התאים ביום 0 עם תאי הזנה מוקרנים ביחס של 1:1 ובצעו את האלקטרופורציה ביום 5 או 6 או 7. החלף את המדיה כל יומיים כפי שתואר קודם לכן ויום לפני ההעברה.
   3. ביום האלקטרופורציה, הכינו בקבוק T25 מלא ב-8 מ"ל RPMI טרי המכיל 100 IU/mL של IL-2 לתאים העוברים אלקטרופורציה וצלוחיות טרום דגירה בחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂<. הערה: תאים מופשרים או תאים שעברו גירוי שני או שלישי יכולים להיות חשמליים בכל עת לאחר התאוששותם כמתואר.
   4. קח 3 - 4 × 10⁶ תאים לכל מצב עבור 26 מיקרוליטר של תערובת התמרה><. הערה: ריכוז גבוה מאוד של תאי NK בתמיסת אלקטרופורציה משפר את קצב ההתמרה.
   5. שטפו את התאים 3 פעמים עם PBS כדי להסיר את כל ה-FBS, המכיל בדרך כלל פעילות RNase. סובב אותם בכל פעם ב -300 x גרם למשך 8 דקות.< br /> הערה: שקול 7 תנאי אלקטרופורציה עבור Cas/RNPs כ-gRNA יחיד (gRNA1, gRNA2, gRNA3) ושילוב של שני gRNAs (gRNA1+gRNA2, gRNA1+gRNA3, gRNA2+gRNA3) ובקרה אחת ללא Cas9/RNPs.
2. צור את crRNA:tracerRNA/complex
   1. השעו מחדש crRNAs (gRNA1, gRNA2 ו-gRNA3) ו-tracerRNA בתמיסת TE 1x לריכוזים סופיים של 200 מיקרומטר. ערבבו 2.2 מיקרוליטר מכל 200 מיקרומטר gRNA עם 200 מיקרומטר tracerRNA כפי שמוצג בטבלה 3.
   2. מחממים את הדגימות בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומניחים להתקרר על הספסל לטמפרטורת החדר (15 - 25 מעלות צלזיוס). אחסן RNA ו-crRNA תלויים: tracrRNA/קומפלקס ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
3. יוצרים את קומפלקס RNP
   הערה: כדי לחסוך זמן, צרו את מתחם ה-RNP במהלך שלב הכביסה 4.1.5.
   1. עבור תגובת דופלקס crRNA יחידה: tracrRNA, יש לדלל את האנדונוקלאז Cas9 ל-36 מיקרומטר כפי שמוצג בדוגמה בטבלה 4.
   2. עבור התמרה משולבת של crRNA:tracrRNA דופלקסים, יש לדלל את Cas9 endonuclease ל-36 מיקרומטר כפי שמוצג בדוגמה בטבלה 5.
   3. הוסף אנדונוקלאז Cas9 ל-crRNA:tracrRNA דופלקסים לאט תוך כדי סיבוב קצה הפיפטה, מעל 30 שניות עד דקה אחת.
   4. דוגרים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 - 20 דקות. אם לא מוכנים להשתמש בתערובת לאחר הדגירה, שמרו את התערובת על קרח עד לשימוש.
4. אלקטרופורציה
   1. הוסיפו את התוסף כולו לתמיסת האלקטרופורציה P3 ושמרו אותו בטמפרטורת החדר.
   2. השעו מחדש את כדור התא (3 - 4 × 10⁶ תאים משלב 4.1.5) ב-20 מיקרוליטר של תמיסת אלקטרופורציה 4D ראשונית P3. הימנע מבועות אוויר בזמן הפיפטינג.
      הערה: אין להשאיר את התאים זמן רב בתמיסת P3.
   3. הוסף מיד 5 מיקרוליטר של קומפלקס RNP (שלב 4.3) לתרחיף התאים.
   4. הוסף 1 μL של משפר אלקטרופורציה Cas9 100 μM לתערובת Cas9/RNPs/תאים.
   5. מעבירים את תערובת Cas9/RNPs/תאים לרצועות אלקטרופורציה של 20 מיקרוליטר.
   6. הקש בעדינות על הרצועות כדי לוודא שהדגימה מכסה את תחתית הרצועות.
   7. הפעל מערכת אלקטרופורציה 4D ובחר בתוכנית EN-138.

טבלה 1. שלושה gRNAs מתוכננים להתמקד באקסון 4 של TGFBR2 ectodomain כ-crRNA סינתטי.

gRNA לא.	רצף gRNA	הוזמן כ-crRNA סינתטי
gRNA1	5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3	/AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrArGrCrUrUrGrGrUrArGrGrCrU
גרנ"א2	5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3	/AltR1/rArUrUrGrCrCrCrUrCrArUrCrArArGrGrCrUrArCrUrArGrGrCrU
גרנ"א3	5 מפרט 3	/AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2/

טבלה 2. פריימרים המשמשים להגברת הגן TGFBR2 ectodomain

TGFBR 2 ectodomain פריימרים FWD	5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3
TGFBR2 ectodomain פריימר REV	5 GGG CCT GAG AAT CTG CAT TTA 3

טבלה 3. צור את ה-crRNA:tracrRNA/קומפלקס באמצעות 200 μM RNA

רכיב	כמות (uL)
200 מיקרומטר crRNA	2.2
200 μM Tracer RNA	2.2
מאגר IDTE	5.6
מוצר סופי	10

טבלה 4. עבור תגובת דופלקס crRNA יחידה: tracrRNA, יש לדלל את האנדונוקלאז Cas9 ל-36 מיקרומטר.

רכיב	כמות (מיקרוליטר)
PBS	1
crRNA:דופלקס tracrRNA (משלב 4.2)	2 (200 חלקים למילול)
Alt-R Cas9 אנדונוקלאז (מלאי 61 מיקרומטר)	2
נפח כולל	5 ul

טבלה 5. עבור התמרה משולבת של crRNA: דופלקסים tracrRNA מדללים את אנדונוקלאז Cas9 ל -36 מיקרומטר.

רכיב	כמות (מיקרוליטר)
PBS	1
crRNA:דופלקס tracrRNA (לדוגמה gRNA1)	1 (100 חלקים מול)
crRNA:דופלקס tracrRNA (לדוגמה gRNA2)	1 (100 חלקים מול)
Alt-R Cas9 אנדונוקלאז	2
נפח כולל	5 מיקרוליטר

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RosetteSep™ קוקטייל העשרה של תא NK אנושי	טכנולוגיות STEMCELL	15065	קוקטייל העשרת תאי NK אנושי RosetteSep™ נועד לבודד תאי NK מדם מלא על ידי ברירה שלילית.
פיקול-פאק® פלוס	GE Healthcare - מדעי החיים	17-1440-02
Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA	טכנולוגיות DNA משולבות	1072532	TracrRNA המכיל שינויים כימיים קנייניים המעניקים עמידות מוגברת לנוקלאז. הכלאה ל-crRNA להפעלת האנזים Cas9
Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA	טכנולוגיות DNA משולבות		מיוצר באופן סינתטי כ-Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, בהתבסס על רצף ה-gRNA המעוצב המכוון לגן האינטרסט
ערכת זיהוי עריכת גנום Alt-R®	טכנולוגיות DNA משולבות	1075931	כל ערכה מכילה אנדונוקלאז T7EI, מאגר תגובה T7EI ובקרות בדיקת T7EI.
פלטינה® טאק DNA פולימראז נאמנות גבוהה	Invitrogen	ברקוד 11304-011
מערכת נוקלאופקטור™ 4D	לונזה	AAF-1002B
חלבון IL-2 רקומביננטי אנושי	נוברטיס	65483-0116-07
ערכת P3 תא ראשוני 4D-Nucleofector™ X	לונזה	V4XP-3032	מכיל וקטור pmaxGFP™, תמיסת נוקלאופקטור™, תוסף, רצועות נוקלאוקובט™ 16 בארות
לא ממוקד: siRNA מותאם אישית, סטנדרטי 0.05 2mol ON-TARGETplus	דהרמקון	CTM-360019
Alt-R® S.p. Cas9 נוקלאז 3NLS	טכנולוגיות DNA משולבות	1074181	Cas9 נוקלאז
מדריך DNeasy® לדם ורקמות	קיגן	69504
ערכת מיני RNeasy	קיגן	74104
Calcein AM	תרמו-פישר	C3099
TGFβ	ביולג'נד	580706
ערכת בקרה Alt-R® CRISPR-Cas9, אנושית	טכנולוגיות DNA משולבות	1072554	כולל tracrRNA, crRNA בקרה חיובית HPRT, crRNA #1 בקרה שלילית, תערובת פריימר HPRT ומאגר דופלקס ללא נוקלאז
IDTE pH 7.5 (תמיסת TE 1X)	טכנולוגיות DNA משולבות	11-01-02-02
Alt-R® Cas9 משפר אלקטרופורציה	טכנולוגיות DNA משולבות	1075915	משפר אלקטרופורציה Cas9

.