$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. ייצור חיסוני שפעת חיים מוחלשים רקומביננטיים על ידי גנטיקה הפוכה
הערה: הפרוטוקול המפורט ליצירת נגיפי שפעת רקומביננטיים על ידי גנטיקה הפוכה תואר במחקרים קודמים והוא מחוץ לתחום דוח זה. בקצרה, חילוץ חיסוני שפעת מותאמים לקור (CAV) נעשה בארון בטיחות ביולוגית Class II תחת הכלת רמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2), וכולל צעדים המפורטים להלן.
- צור חיסון שפעת מותאם להצטננות רה-אסורטנטי באמצעות הזן A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) המותאם לקור, כמו גם את ההמגלוטינין (HA) ונוירמינידז שונה (NA) של זן A/PR/8/34 (H1N1) (איור 1A). השינוי בגן NA מורכב מהחלפה מבוססת PCR של רצף שמור בגבעול החלבון (שאריות 65 עד 72) ברצף cDNA קצר המקודד את הפפטיד SIINFEKL שמקורו באובאלבומין עוף (OVA) (איור 1B). פפטיד SIINFEKL הוא פפטיד אימונודומיננטי מאוד בהקשר של התגובה המוגבלת H-2b MHC Class I של עכברי C57BL/6.
- צלחת 106 293T תאים לכל באר בצלחות 6 בארות באמצעות DMEM 10% סרום בקר עוברי (FBS) בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P / E).
- הכינו תערובת טרנספקציה פלסמידית: הוסיפו 1 מיקרוגרם מכל אחד מהפלסמידים המקודדים cDNA עבור PB2, PB1, PA, NP, M, NS מזן שפעת A/אן ארבור/6/60 ו-1 מיקרוגרם של הפלסמידים המקודדים עבור NA-SIINFEKL ו-HA משפעת A/PR/8/34. הוסף Opti- Minimal essential medium מחומם מראש (Opti-MEM) (15 μl לנפח סופי של 100 μl/well).
- לדגור על תערובת טרנספקציה במשך 30 דקות ב- RT.
- מוסיפים 100 μl של תערובת טרנספקציה / באר ודגרים במשך 16 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.
- שנה מדיה סלולרית על ידי DMEM 0.3%, BSA, 1% P/E ב 33 ° C ו 5% CO2 במשך 5 שעות.
- הוסף 106 תאי כליות כלבים מתירניים של Madin-Darby (MDCK) לדימתיל סולפוקסיד (DMSO) המכילים 1 מיקרוגרם/מ"ל טריפסין מלבלב בקר שטופל ב- L-1-Tosylamide-2-phenylethyl chloromethyl ketone (TPCK-trypsin). שמור על תרביות משותפות 293T-MDCK במשך 2-3 ימים בטמפרטורה של 33°C ו-5% CO2.
- יש לאסוף סופרנאטנטים של תרביות תאי MDCK-293T ולנקות באמצעות צנטריפוגה במהירות של 260 x גרם למשך 5 דקות.
