מודל תלת מימדי של תרבית משותפת של חדירת תאי T לספרואידים סרטניים

תקציר

מקור: Lin, Y., et al. Monitoring Cancer Cell Invasion and T-cell cytotoxicity in 3D Culture. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים שיטה לביסוס ספרואיד גידול תלת ממדי ותרבית משותפת של תאי T. אגרוז יצוק עם microwells המכילים spheroids הגידול מוכן, ואחריו תוספת של תאי T. לאחר הדגירה, מערך זה מאפשר לחקור את האינטראקציה של תאי T עם ספרואידים סרטניים בסביבה תלת ממדית מבוקרת.

פרוטוקול

1. יצירת ספרואידים

1. להכין autoclave 2% agarose ב 1x פוספט-buffered מלוחים (PBS) (למשל, 1 גרם agarose ב 50 מ"ל של 1x PBS) ו autoclave 35- ו 81-microwell תבניות גומי.
   זהירות: הימנע משימוש באגרוז בעל התכה נמוכה ליצירת יציקות האגרוז לעיבוד אימונוהיסטוכימיה (IHC).
2. הכנת יציקות אגרוז
   הערה: יציקות 35 מיקרו-באר משמשות לפלישה, אימונופלואורסנציה (IF) ומבחני בידוד תאים. יציקות 81-microwell משמשות עבור ציטוטוקסיות, IHC, בידוד תאים ומיצוי חומצה ריבונוקלאית (RNA).
   1. לאחר שהאגרוז עבר אוטוקלאב, תנו לאגרוז המותך להתקרר לכ-60 מעלות צלזיוס. במכסה מנוע של תרבית תאים, השתמש בטכניקה אספטית ופיפטה 500 μL של אגרוז מותך לתוך תבנית גומי 81-microwell לכל באר או 330 μL לתוך תבנית גומי 35-microwell לכל באר.
      זהירות: הימנעו מיצירת בועות בזמן ערבוב או פיגור אגרוז. הסר את כל הבועות על ידי pipetting בעדינות.
   2. לאחר שהאגרוז מתמצק, מכופפים בזהירות את תבנית הגומי כדי להסיר ממנה את יציקת האגרוז. בזאת, הניחו את הידיים מעל צלחת הבאר המתאימה והניחו ליציקת האגרוז לצנוח היישר לתוך באר אחת של צלחת הבאר.
      הערה: להגמיש את תבנית הגומי במיקומים שונים על מנת למנוע כיפוף יתר. כדאי להגמיש את תבנית הגומי ולדחוף בעדינות מהתחתית באותו הזמן.
   3. כדי לאזן את יציקות האגרוז, הוסיפו מדיום תרבית תאים, המורכב ממדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (2.5 מ"ל/באר עבור צלחת 12 בארות ו-1 מ"ל/באר עבור צלחת 24 בארות). הכניסו את צלחת הבאר לאינקובטור תרבית תאים (37°C, 5% CO₂) ודגרו במשך שעה אחת.
3. בינתיים, הכינו תרבית תאים לזריעה.
   הערה: מספר זריעת התאים הכולל לכל יציקת אגרוז ייקבע על ידי החוקר. עבור קווי תאים ראשוניים של סרטן הלבלב, 35,000 תאים / 35-microwell יצוק ו 81,000 תאים / 81-microwell יצוק (בממוצע 1000 תאים / spheroids) נזרעים עבור כל הבדיקות הבאות. הקוטר הממוצע של ספרואיד הוא כ-150-12200 מיקרומטר לאחר 48 שעות.
4. הסר תחילה את מדיום תרבית התאים המקיף את יציקת האגרוז עם פיפטה P1000 על ידי הטיית צלחת הבאר. לאחר מכן הסר בזהירות את המדיום בתא הזריעה.
5. זרעו בזהירות את תרחיף תאי הגידול המוכן בטיפה לתוך תא זריעת התא. החזירו בזהירות את צלחת הבאר לאינקובטור תרבית התאים (37°C, 5% CO₂) למשך 15 דקות.
   הערה: במהלך שלב זה התאים יתיישבו לתוך microwells של יציקת agarose.
6. מוסיפים תווך נוסף לחלק החיצוני של יציקת האגרוז (2.5 מ"ל/באר לצלחת 12 בארות ו-1 מ"ל/באר לצלחת 24 בארות).
7. החזירו את צלחת הבאר לאינקובטור תרבית התאים (37°C, 5% CO₂) למשך 48 שעות
   הערה: בדרך כלל לוקח עד כמה שעות לתאים ליצור ספרואידים במיקרו-בארות. באופן כללי, ספרואידים של תאי גידול מוצקים נוצרים לאחר 24 שעות ויציבים לאחר 48 שעות. עם זאת, הדבר עשוי להשתנות בין שורות תאים שונות. במידת הצורך, יש לשנות את מדיום תרבית התאים על ידי הטייה זהירה של צלחת הבאר עם יציקות האגרוז והסרת מדיום תרבית התאים שמסביב עם פיפטה P1000. לאחר מכן מוסיפים בזהירות מדיום טרי על ידי פיפטציה לאורך קיר הבאר. בדרך כלל אין צורך לשנות את המדיה בתוך הגבס בשל נפח קטן שלה ואת הסיכון של הסרת spheroids.

2. תרבית משותפת עם תאי T

1. יש להשהות מחדש את המספר הנדרש של תאי T ב-75 μL (יציקת 35 מיקרו-וול) או ב-190 μL (יציקת 81 מיקרו-וול) של מדיום תרבית תאי T המתאים (RPMI בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-100 יחידות/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין).
2. הסר תחילה את מדיום תרבית התאים המקיף את יציקת האגרוז עם פיפטה P1000 על ידי הטיית צלחת הבאר. לאחר מכן הסירו לאט ובזהירות את המדיום בתוך הגבס על ידי התמקדות עדינה בפינה אחת של תא הזריעה עם פיפטה P200 תוך שמירה על הצלחת מוטה ביד השנייה.
3. (שלב קריטי 1) מכיוון שקיים סיכון להסרת ספרואידים, בקרה על אובדן ספרואידים על ידי השוואת מספר הספרואידים בתוך המיקרו-בארות לפני ואחרי הסרת התווך על ידי צפייה מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 10.
4. זרעו בזהירות את מתלה תאי ה-T בטיפה לתוך תא הזריעה של יציקת האגרוז על ידי החזקת פיפטת P200 כ-0.5 ס"מ מעל הגבס.
5. (שלב קריטי 2) קיים סיכון של שטיפת הספרואידים החוצה בעת הוספת תאי T. לכן, קריטי להוסיף את תאי T לאט מאוד וכ-0.5 ס"מ מעל תא הזריעה.
   הערה: אפשרות אחת להפחית את מספר הספרואידים הסמוקים היא על ידי הפניית הפיפטה לפינה אחת של תא הזריעה תוך הוספת תאי T, ובכך רק להסתכן בכך שהספרואידים בפינה זו יישטפו החוצה.
6. מניחים בזהירות את צלחת הבאר בחזרה לתוך אינקובטור תרבית התא (37 ° C, 5% CO₂) במשך 15 דקות.
7. הוציאו את צלחת הבאר מהאינקובטור והוסיפו מדיום תרבית תאים טרי (Roswell Park Memorial Institute media (RPMI) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי ו-100 יחידות/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין) סביב יציקת האגרוז על ידי פיפטציה איטית לאורך דופן הבאר.
8. החזירו את צלחת הבאר לאינקובטור תרבית התאים למשך 48 שעות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות פטרי תלת מימד	Microtissues Inc	Z764019 Z764051	מכונות "תבניות גומי" בפרוטוקולים; תבניות 81-microwell ו-35-microwell
שקופיות קאמריות עם 8 בארות	לאב-טק	154534
אגרוז סוג I, EEO נמוך	סיגמא-אולדריץ'	A6013
DMEM, סרום בקר עוברי	תרמופישר	11965092, 16000044	המכונה "מדיום תרבית תאים" בפרוטוקולים
סל"ד	תרמופישר	11875093	עבור מדיום תרבית תאי T