העברה בתיווך אקופקציה של גנים הקשורים למערכת החיסון לרקמות העור של עכברים

תקציר

מקור: Lin, Y., et al., פיתוח מערכת העברת DNA חסכונית על ידי "אקופקציה" ויישומה לחקר העור. J. Vis. Exp. (2017)

הסרטון מדגים שיטה להעברה ישירה של DNA פלסמיד מקודד אינטרלוקין-15 לרקמת העור של מודל עכבר חסר אינטרלוקין-15 באמצעות דיקור באמצעות מיקרו-מחטים. מיקרו-מחטים אלה מייצרות מיקרו-נקבים בשכבת העור החיצונית ביותר, מה שמקל על ספיגה והעברה של DNA פלסמיד לתאי האפידרמיס, כולל קרטינוציטים, בתוך רקמת העור.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. נוהל אקופקציה

הערה: הכמות האופטימלית של DNA ואזור פני השטח של עור היעד עשויים להשתנות עבור גנים שונים ויש צורך למטב אותם עוד יותר. כוח הדקירה ומספר הפעמים לשחרר את שכבת החרמן של העור עשויים גם להשתנות בהתאם לעובי העור. תנאים אלה חייבים להיקבע בקפידה לאחר הערכת רמת הביטוי של תעתיקי גנים acufected על ידי qRT-PCR.

1. לשקול את העכברים ולתת tribromoethanol (400 מיקרוגרם לכל gm משקל הגוף) על ידי הזרקת פריטוניאלי.
   הערה: 2,2,2-tribromoethanol הוא חומר הרדמה בהזרקה שהיה נפוץ בעכברים. תמיסות מיוצרות על ידי המסת 2,2,2-tribromoethanol (2.5 גרם) לא תרופתי במים מזוקקים (200 מ"ל) המכילים 2.5% של 2-methyl-2-butanol.
2. השתמש משחה אופתלמולוגית וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש תחת הרדמה.
   הערה: אפקט הרדמה יושרה תוך 1 - 2 דקות. בדוק את רפלקס צביטת הבוהן כדי להבטיח עומק מספיק של הרדמה לפני הניתוח.
3. יש לגלח את העור הצדדי הגבי ולמרוח קרם דהפילטורי להמסת חלבוני קרטין בשערה.
   הערה: שימוש בקרם depilatory כדי להסיר שיער יקל על עירוי של DNA לתוך העור.
4. השתמש בצמר גפן ספוג מים כדי לנגב את קרם depilatory.
   הערה: קרם depilatory מסיס במים. הסרה מלאה של הקרם תמנע משטח שמנוני ותבטיח תוצאת דקירה טובה יותר.
5. השתמשו במקלון צמר גפן סטרילי ספוג באתנול 70% לחיטוי פני העור.
6. סמנו את אזור המטרה (1 ס"מ על 1 ס"מ) על העור המנוטרל עם שבלונה מדודה מראש. הערה: סימון אתר היעד יעזור ליישם את צרור המחט למעלה ולמטה בתוך אזור מוגדר. זה חשוב כדי להבטיח העברה של אותה כמות של דנ"א לאזור פנים מסוים כדי למזער את השונות בין ניסוי לניסוי.
7. יש להניח טיפה של 10 μL של DNA פלסמיד (10 מיקרוגרם) על העור המסומן.
   הערה: כמות הדנ"א לאקופקציה משתנה בהתאם לגנים שונים ולסוג וקטור הביטוי. כמות ה- DNA המשמש צריך להיות titrated בזהירות לפני ביצוע הניסוי של עניין. 10 μL היא טיפה נוזלית קטנה והיא יושבת היטב על העור המגולח והמגולגל מבלי להתגלגל למטה בזמן הדקירה. כלול קבוצת ביקורת של עכברים שטופלו ב- DNA וקטורי ריק של 10 μL כדי להשוות לעכברים שטופלו בגן המחקר.
8. החזיקו את צרור מחטי הדיקור (איור 1B) ודקרו את המשטח המסומן בתנועה של מעלה ומטה במשך 100 פעמים או עד שהלחות מהדנ"א ב-PBS על העור תיעלם. הערה: תיתכן אדמומיות מסוימת של פני העור. הימנע מביצוע חתכים עמוקים המדממים.
   מספר תנועות הדקירה למעלה ולמטה על פני העור נקבע באופן אופרטיבי כאשר הלחות מהדנ"א ב- PBS (10 μL) נעלמת על העור. החלטנו 100 פעמים ב-30 שניות כי זה נתן את התוצאות העקביות ביותר מגנים שהועברו על ידי אקופקציה. במידת הצורך, ניתן לעשות שימוש חוזר במחטים עבור עד 6 דקירות עור מטרה (1 ס"מ x 1 ס"מ כל אחת). שטפו את המחטים ב-70% אתנול ו-PBS בין אקופקציה. החליפו למחטים חדשות כאשר הן עמומות או לדנ"א פלסמיד שונה כדי למנוע זיהום צולב.
9. הניחו עכברים על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף עד לערות.
10. להחזיר עכברים לכלוב שלהם כאשר הם חזרו להכרה מספקת. הערה: החזיקו עכברים נגועים בכלוב נפרד (פחות מ-5 בעלי חיים בכל כלוב) מכלוב של עכברים לא נגועים.
11. הניחו בקבוק מים במקומו והחזירו את הכלוב למתלה IVC (כלוב מאוורר בנפרד).

2. טיפול לאחר ניתוח

1. במשך 48 השעות הראשונות לאחר ההליך, עקוב מקרוב אחר עכברים עבור כל אי נוחות, כולל שינויים התנהגותיים (חוסר מנוחה, אי שקט או הפרעת אכילה) או מראה חריג (מעיל שיער מחוספס או יציבה כפופה).

תוצאות

איור 1. איור של מחטי דיקור. (A) מחט הדיקור (36 גרם x 0.5 אינץ') מורכבת מידית וקצה מחט. (B) עשר מחטי דיקור קשורות בצרור באמצעות סרטי הדבקה. אורך הצרור הוא כ-4 ס"מ כפי שנמדד על ידי הסרגל (הפאנל התחתון).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחט שימושית של Accu	עכו	36Gx0.5	מכשור רפואי
תחליבNair TM	צ'רץ' ודווייט	לא ישים	השתמש להסרת שיער
תחליף שנדון קסילין	תרמו פישר סיינטיפיק	6764506	דה-פרפיניזציה
אברטין (2,2,2-טריברומתנול)	סיגמא-אולדריץ'	T4,840-2	הרדמה
2-מתיל-2-בוטנול	סיגמא-אולדריץ'	152463	ממס לפירוק אברטין
ערכת מידי פלסמיד QIAGEN®	קיאגן	12143	טיהור DNA פלסמיד מ E. coli
עכבר IL-15/IL-15R קומפלקס ELISA ערכת Ready-SET-Go	eBioscience	88-7215	מדידת חלבון IL-15

עכבר