בדיקת מבחנה להערכת הפעילות האנטי-סרטנית של תאי CAR T ספציפיים לגידול

תקציר

מקור: Kueberuwa, G., et al. מודל סינגני של לימפומה של תאי B בעכבר להערכה פרה-קלינית של תאי CD19 CAR T. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים בדיקת מבחנה לאימות פעילות תאי T של קולטן אנטיגן כימרי (CAR). תאי לימפומה של תאי B המבטאים אנטיגן CD19 ולוציפראז ציטופלזמי מיוצרים בתרבית משותפת עם תאי CAR T ספציפיים ל- CD19. קשירת CAR ל- CD19 על גידול גורמת לתאי CAR T לשחרר ציטוקינים ורעלים הגורמים לציטוטוקסיות של תאי הגידול. פעילות תאי CAR T מוערכת על ידי כימות הציטוקין המשתחרר וירידה ביולומינסנציה בתיווך לוציפראז בתאי הגידול.

פרוטוקול

1. אימות חוץ גופי של פעילות תאי CAR T

1. זרע סינגני מטרה תאי גידול CD19+ עם או בלי ביטוי luciferase בצפיפות של 1 x 10⁴ תאים ב 100 μL שלם תא T בינוני (TCM) / באר בצלחת תרבית רקמה U-bottom 96 באר
.
2. הוסף 1 x 10⁴ CD19 CAR T תאים/באר בנפח של 100 μL/well כדי להשיג יחס אפקט למטרה (E:T) של 1:1.
   הערה: יש לקבוע יחסי E:T עבור כל מבנה CAR וקו תא יעד.
3. השתמש בתאי T בלבד ובתאי הגידול לבדם כבקרות שליליות ובתאי T המעוררים על ידי פורבול-מיריסטט-אצטט (PMA) (50 ננוגרם/מ"ל) ויונומיצין (1 מיקרוגרם/מ"ל) כבקרה חיובית לשחרור אינטרפרון-גמא (IFNγ). תאי תרבית משותפת ב 37 ° C, 5% CO₂ במשך 16-24 שעות.
4. לאחר תרבית משותפת, צנטריפוגו את הצלחות במהירות של 500 x גרם למשך 5 דקות ואספו את הסופרנאטנט לניתוח נוסף של IFNγ ו- IL-12p70 ELISA.
   הערה: זה יכול להיות מאוחסן ב -80 °C.
5. כדורי תא להשהות מחדש ב 100 μL של PBS המכיל luciferin (ריכוז סופי של 1.5 מ"ג / מ"ל). לדגור על הצלחות במשך 10 דקות ב 37 ° C. לאחר מכן למדוד את ההארה מכל באר עם luminometer מתאים.
   הערה: יש למטב את זמני החשיפה לקווי התאים ולצפיפותם. תוצאות מייצגות מוצגות באיור 1a. ציטוטוקסיות Ex-vivo של תאי CAR T יכולה להשתנות כדי לבטא לוציפרין על ידי תרבית משותפת עם קווי תאים המבטאים אנטיגן מטרה. כאשר תאי CAR T הורגים תאי מטרה, לוציפרין משתחרר, ולכן ירידה באות הלומינומטריה מתואמת עם הריגת תאים. תאים שאינם מותמרים יכולים לעתים קרובות להשפיע על יכולת הקיום של תאי המטרה, במיוחד לאורך תקופות דגירה ארוכות. למדוד את הריכוז של murine IFNγ ו- IL-12p70 בסופרנאטנט על פי פרוטוקולי ELISA של היצרן. תוצאות מייצגות מוצגות ב-(איור 1b ו-1c). הפעלה Ex-vivo של תאי CAR T על ידי תרבית משותפת עם קווי תאים המבטאים אנטיגן מטרה יכולה להיות מאוששת על ידי ניתוח תוכן supernatant באמצעות ELISA. היחס בין תא CAR T לתאי המטרה ואורך תקופת התרבית המשותפת חייבים להיות אופטימליים עבור כל מבנה CAR, קו תא מטרה וניתוח. טיפול PMA ויונומיצין יכול לשמש כבקרה חיובית כדי לאשר את איכות תאי T ואת יכולתם להגיב.

תוצאות

איור 1. אימות פעילות תאי CAR T. תאי αmCD19 CAR T גודלו בתרבית משותפת עם תאי לימפומה A20 שהותאמו לבטא לוציפראז (1 x 10⁴: 1 x 10⁴) במשך 16 שעות בצלחת U-bottom 96-well. לאחר תרבית משותפת, תאים היו כדורים, supernatant נאסף. A) תאים הושעו מחדש ב-PBS ונעשה שימוש בלומינומטריה כדי להעריך את הכדאיות של תאי המטרה. Supernatant מתרבות משותפת הוערך עבור נוכחות IFNγ (...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100X פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (PSG)	גיבקו	10378016
ציטומטר זרימה - LSR Fortessa x20	BD Biosciences	658222R1
סרום בקר עוברי	גיבקו	10270
ערכת ELISA ללא ציפוי עכבר IL-12 p70	Invitrogen	88-7121-76
יונומיצין מלח סידן	סיגמא- אולדריץ'	I0634
לומינומטר - Lumistart Omega	BMG Labtech	415-301
ערכת ELISA של Murine IFN-γ	דיאקלון	861.050.010
פורבול 12-מיריסטט 13-אצטט (PMA)	סיגמא- אולדריץ'	P8139
סל"ד 1640 בינוני	לונזה	BE12-167F
XenoLight D-לוציפרין	פרקין אלמר	122799