בדיקת מבחנה להערכת ציטוטוקסיות של תאי הרג טבעיים כנגד תאים סרטניים

תקציר

מקור: Baik, C. H., et al. A Plate-based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Rat Placental Natural Killer Cell Cytolytic Function. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים ביצוע בדיקת שחרור לקטט דהידרוגנאז כדי לקבוע את ציטוטוקסיות תאי הרג טבעי (NK) כנגד תאי סרטן המטרה. הבדיקה מכמתת את שחרורו של האנזים ציטופלזמי לקטט דהידרוגנאז מתאי סרטן על ידי מדידת הספיגה של המוצר בצבע אדום שנוצר.

פרוטוקול

1. בדיקת ציטוטוקסיות: פרוטוקול Assay

1. השתמש בתחתית עגולה, צלחת מטופלת בתרבית 96 בארות כדי לסדר את הצלחת כפי שהוצע בטבלה 1. טבלה זו מציגה את פקדי הניסוי ו- 3 קבוצות של עמודות ניסוי NK. ניתן להרחיב זאת לסך של 10 עמודות ניסוי NK בלוח 96 בארות.
2. צנטריפוגה את צלחת הבדיקה ב 250 x גרם במשך 4 דקות כדי להיות בטוח כי האפקט ותאי המטרה נמצאים במגע. לדגור על צלחת 96 בארות במשך 5 שעות באינקובטור תא לח ב 37 ° C, 5% CO₂ כדי להשיג מגע מספיק בין תאי המטרה ו אפקט ליזה תא המטרה על ידי תאים משפיעים.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
3. 45 דקות לפני קצירת סופרנאטנטים, הוסף 10 μL של תמיסת ליזה 10x לבארות שחרור LDH מרבי של תא היעד (בארות 1E, 1F, 1G ו- 1H) והחזיר את הצלחת לתא הלח.
4. לאחר השלמת זמן הדגירה, צנטריפוגה את הצלחת ב 250 x גרם במשך 4 דקות. באמצעות pipettor, להעביר 50 μL aliquots מכל הבארות לצלחת בדיקה שטוחה 96 בארות טרי.
   הערה: אין לגעת בתחתית הבארות כדי שהתאים לא יועברו לצלחת הבדיקה הטרייה. אין להשתמש בצלחת מטופלת מתורבתת כצלחת הבדיקה הטרייה.

2. הפוך מגיב Assay.

1. לאחר שמאגר Assay הגיע לטמפרטורת החדר, הוסף 12 מ"ל של מאגר Assay לבקבוק Substrate Mix אחד. יש להפוך ולנער בעדינות עד להמסה מלאה. בקבוק אחד מספיק לשתי צלחות 96 בארות.
   הערה: Assay Buffer צריך להיות מוגן מפני אור בזמן הפשרה. יש לערבב מיד לפני השימוש.
2. הוסף 50 μL של מגיב Assay לכל הבארות בצלחת הבדיקה משלב 4.6. מכסים את הצלחת בנייר כסף כדי להגן עליה מפני אור ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: מגיב Assay חדש צריך להיות מאוחסן במקפיא. מגיב טוב במשך כ 8 שבועות.
3. הוסף 50 μL של Stop Solution לכל באר. יש לקרוא את הלוח תוך שעה לאחר הוספת Stop Solution ולרשום את הספיגה ב-490 nm.
   נתונים מייצגים מוצגים בטבלה 2.

טבלה 1: פריסת צלחת Assay. TCS = תא יעד שחרור LDH ספונטני (50 μL תאי מטרה + 50 μL תא יעד בינוני); TCM = שחרור LDH מרבי של תא יעד (50 μL תאי מטרה + 50μL תא יעד בינוני); VCC = בקרת תיקון נפח (50 μL תא יעד בינוני + 50 μL NK תא בינוני); CMB = בקרת רקע בינונית של תרבית (50 μL תא יעד בינוני + 50 μL מדיום תא NK); ECSR = שחרור ספונטני של תאי אפקט (50 μL תאי NK + 50 μL תאי NK בינוניים); EW = בארות ניסוי (50 μL תאי מטרה + 50 μL תאי NK).

1	2	3	4	5
TCS	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
TCS	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
TCS	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
TCS	VCC	ECSR-1	ECSR-2	ECSR-3
TCM	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
TCM	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
TCM	CMB	EW-1	EW-2	EW-3
TCM	CMB	EW-1	EW-2	EW-3

טבלה 2: נתוני ספיגה גולמיים של צלחת בדיקה המכילה את בקרות הניסוי בעמודות 1 ו-2 ובארות ניסוי למדידת ציטוטוקסיות של תאי NK שליה מחולדות NP ו-RUPP כנגד תאי מטרה מסוג YAC1.

1	2	3	4	5
		NP	רופ	NP
0.615	0.484	0.473	0.463	0.471
0.586	0.484	0.458	0.474	0.469
0.61	0.486	0.464	0.459	0.469
0.605	0.55	0.524	0.526	0.543
0.576	0.504	0.519	0.502 0.528	00.528
0.565	0.512	0.515	0.513	0.531
0.563	0.581	0.526	0.508	0.519

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת תרבית רקמות 96 בארות	CELLTREAT	229190	סטרילי, תחתון עגול
מגרד תאים	פישר	8100241
ערכת בדיקת ציטוטוקסיות לא רדיואקטיבית Cytotox 96	פרומגה	G1780
סל"ד	גיבקו	11875135	1640 בינוני
תא YAC-1	ATCC	TIB-160