1. סינתזת פוליקפרולקטון טריאקרילט (PCLTA)
- יבש 3.2 מ"ל של 400 Da polycaprolactone (PCL) טריול לילה ב 50 ° C בבקבוק תחתון עגול פתוח 200 מ"ל אשלגן פחמתי (K2CO3) בבקבוקון זכוכית ב 90 ° C.
- ערבבו את הטריול עם 6.4 מ"ל של דיכלורומתאן (DCM) ו-4.246 גרם של K2CO3 תחת ארגון.
- מערבבים 2.72 מ"ל של אקרילויל כלוריד ב-27.2 מ"ל של DCM ומוסיפים טיפה לתערובת התגובה בבקבוק במשך 5 דקות.
- מכסים את תערובת התגובה ברדיד אלומיניום ומשאירים אותה ללא הפרעה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות תחת ארגון.
- לאחר 24 שעות, סנן את תערובת התגובה באמצעות נייר סינון על משפך Buchner תחת ואקום כדי להשליך ריאגנטים עודפים.
- יש לזרז את הסינון משלב 1.5 המכיל את הפולימר הסופי באתר דיאתיל ביחס של 1:3 (vol/vol) ולסובב ב-30°C כדי להסיר את אתר הדיאתיל.
2. היווצרות הפוליבועה
הערה: הזרקת פולימר למים שעברו דה-יוניזציה (DI) תגרום לפוליבועות לנדוד לתחתית הבקבוקון וכתוצאה מכך לקרקעית שטוחה. השתמש 10% (wt/vol) carboxymethyl cellulose (CMC) כדי למלא את בקבוקון הזכוכית במקום כדי למנוע שיטוח polybubble.
- הכן תמיסת CMC 10% (wt/vol) במי DI.
- מלא בקבוקון זכוכית 0.92 מ"ל עם 0.8 מ"ל של 10% CMC באמצעות פיפט העברה 1 מ"ל.
- יש לערבב 1000 מ"ג/מ"ל של 14 kDa PCL ב-DCM ולסנתז PCLTA ביחס של 1:3 (vol/vol) לקבלת נפח כולל של 200 μL או להכין 200 μL של 1000 מ"ג/מ"ל של 5 kDa poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate (PLGADA) בכלורופורם.
- ערבבו את 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (photoinitiator) עם תערובת פולימר (PLGADA או PCL/PCLTA) ב-0.005:1 (vol/vol).
- טען 200 μL של תערובת פולימר לתוך מזרק זכוכית 1 מ"ל המורכב על משאבת מזרק המחובר לצינור נירוסטה נירוסטה בקוטר פנימי של 0.016 אינץ '.
- השתמש במיקרו-מנוע כדי לשלוט בתנועה קדימה ואחורה של צינור הפולימר כדי להזריק פולימר לתוך 10% CMC בבקבוקון הזכוכית כדי ליצור את הפוליבועה.
- לרפא את polybubbles תחת אולטרה סגול (UV) באורך גל 254 ננומטר במשך 60 s ב 2 W / cm2.
- הבזק להקפיא את polybubbles בחנקן נוזלי lyophilize לילה ב 0.010 mBar ואקום ב -85 ° C.
- הפרידו את הפוליבועות מה-CMC המיובש באמצעות מלקחיים ושטפו את הפוליבועות במי DI כדי להסיר שאריות CMC. שים לב שניתן להשתמש בפולימרים אחרים, ככל הנראה עם שינויים כדי לשנות את קינטיקה השחרור.
3. אפנון קוטר פוליבועה
- מלא בקבוקון זכוכית 0.92 מ"ל עם 10% CMC באמצעות צינור העברה 1 מ"ל.
- יש לערבב PCL/PCLTA ביחס של 1:3 (vol/vol) עם 1000 מ"ג/מ"ל 14kDa PCL ולסנתז PCLTA. ערבבו את יוזם הפוטו עם תערובת פולימרים ביחס של 0.005:1 (vol/vol).
- טען את תערובת הפולימר לתוך מזרק זכוכית 1 מ"ל המורכב על משאבת מזרק המחוברת לצינור נירוסטה מחלק בקוטר פנימי של 0.016 אינץ '.
- השתמש במיקרו-מנוע כדי לשלוט בתנועה קדימה ואחורה של צינור הפולימר כדי להזריק פולימר לתוך 10% CMC בבקבוקון הזכוכית כדי ליצור את הפוליבועה.
- כדי לקבל polybubbles עם קטרים שונים, לשנות קצב ניפוק מ 0.0005 ל 1 μL / s.
- צלם תמונות של הבקבוקון עם polybubbles בקוטר משתנה.
- השתמש ב- ImageJ כדי לכמת את קוטר הבועות ולהשתמש בגודל הבקבוקון כקנה מידה.
4. מרכוז מטען בתוך פוליבועה
- אפנון צמיגות PCL/PCLTA באמצעות K2CO3:
הערה: צמיגות PLGADA אינה חייבת להשתנות באמצעות K2CO3 מכיוון שהצמיגות של 5 kDa PLAGDA ב 1000 מ"ג / מ"ל מספיקה למרכז המטען.
- הוסף K2CO3 (שבודד לאחר תגובת PCLTA) ל- PCLTA בריכוזים משתנים כולל 0 מ"ג / מ"ל, 10 מ"ג / מ"ל, 20 מ"ג / מ"ל, 40 מ"ג / מ"ל ו 60 מ"ג / מ"ל.
- מדוד את הצמיגות הדינמית של התמיסות על ידי שינוי קצב הגזירה מ- 0 ל- 1000 1/s באמצעות ראומטריה.
- הזריקו ידנית את המטען באמצע (עיין בשלב 4.2 להכנת תערובת המטען) של הפוליבועות שנוצרו באמצעות תמיסות PCL/PCLTA עם ריכוזים שונים של K2CO3 (שלב 4.1.1). קבע את הריכוז האופטימלי של K2CO3 על ידי התבוננות איזו תמיסה משלב 4.1.1 יכולה לגרום לשימור המטען באמצע.
- מרכוז המטען (שכבר הוכח היתכנות עם מולקולות קטנות) עם CMC
- ערבבו את המטען עם CMC 5% (wt/vol) במסובב למשך הלילה כדי להגביר את צמיגות המטען.
- הזריקו ידנית 2 μL של תערובת מטען בפוליבוע והמשיכו עם ריפוי UV באורך גל של 254 ננומטר למשך 60 שניות ב 2 W / cm2.
- הבזק להקפיא את polybubbles בחנקן נוזלי במשך 30 s ו lyophilize לילה ב 0.010 mBar ואקום ב -85 ° C.
- יש להפריד את הפוליבועות מה-CMC המיובש באמצעות מלקחיים ולשטוף במי DI כדי להסיר שאריות CMC.
- חתכו את הפוליבוע לשניים ודמו את החצאים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לוודא שהמטען ממורכז (עיין בשלב 6 עבור עירור ואורכי גל פליטה בשימוש).
5. ניסוח מטען
הערה: נוסחת פוליבוע יכולה להכיל סוגי מטען שונים, כולל מולקולות קטנות, חלבונים וחומצות גרעין.
- בהתבסס על מחקרים קודמים, במקרה של מטען חלבונים, השתמש בחומרים בלתי פעילים כולל פוליאתילן גליקול (PEG), פוליוויניל פירולידון (PVP) וגליקופולימרים כדי לשפר את יציבות החלבון במהלך ניסוח פוליבוע.
- טופס polybubbles בהתבסס על הפרוטוקול בשלב 2.
- הכן את פתרון האנטיגן על ידי הוספת 17.11 גרם של trehalose ל 625 μL של אנטיגן HIV gp120/41.
- הזריקו ידנית 1 μL של תמיסת אנטיגן באמצע הפוליבועה.
- פתחו פוליבועות בימים 0, 7, 14 ו-21, ותיעדו את הפלואורסצנטיות של האנטיגן באורכי גל עירור ופליטה של 497 ננומטר ו-520 ננומטר, בהתאמה.
- לקבוע את הפונקציונליות של האנטיגן באמצעות אנזים מקושר immunosorbent assay (ELISA) ולהשתמש 5% חלב ללא שומן כמו מאגר חוסם.
6. שחרור מטען
הערה: מולקולה קטנה או אנטיגן יכולים לשמש כסוג המטען
- מולקולה קטנה
- לדגור polybubbles עם acriflavine ממורכז ב 400 μL של מלוחים חיץ פוספט (PBS) ב 37 ° C, 50 ° C עבור פוליבועות PLGADA וב 37 ° C, 50 ° C, 70 ° C עבור polybubbles PCL/PCLTA.
הערה: הסיבה שאנו ממליצים לבדוק מעל טמפרטורת הגוף היא א) לדמות את הטמפרטורה (50 ° C) שבה הפוליבועה מגיעה תוך לייזר ננו-מוטות הזהב (AuNRs) בתוך PCL ו- PLGA; ב) להאיץ את תהליך הפירוק של PCL (50 ° C, 70 ° C).
- בכל נקודת זמן, אספו את הסופרנאטנטים והחליפו ב-400 מיקרוליטר של PBS טרי.
- השתמש בקורא לוחות כדי לכמת את עוצמות הפלואורסצנטיות בסופרנאטים שנאספו.
הערה: השתמש ex/em של 416 nm/514 nm עבור acriflavine.
- אנטיגן
- לדגור על פוליבועות עם סרום אלבומין בקר ממורכז (BSA)-488 ב-400 μL של PBS ב-37°C, 50°C ב-PLGADA polybubbles וב-37°C, 50°C ב-PCL/PCLTA polybubbles.
- בכל נקודת זמן, אספו את הסופרנאטנטים והחליפו ב-PBS טרי של 400 מיקרוליטר
.
- השתמש בקורא לוחות כדי לכמת את עוצמות הפלואורסצנטיות בסופרנאטים שנאספו. השתמש ב- ex/em של 497 nm/520 nm עבור BSA-488.
הערה: אין לבצע מחקר שחרור בטמפרטורה של 70°C עבור פוליבועות PCL/PCLTA כדי למנוע חשיפת האנטיגן לטמפרטורה קיצונית.