בדיקה להערכת ההשפעות האנטי-סרטניות של סופרנאטנט נטול תאי לקטובצילוס

תקציר

מקור: Lee, J., et al. הערכת מוות תאי באמצעות סופרנאטנט ללא תאים של פרוביוטיקה בתרביות כדוריות תלת ממדיות של תאי סרטן המעי הגס. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים בדיקה חוץ גופית לחקר ההשפעות האנטי-סרטניות של לקטובצילוס ללא תאי סופרנאטנט (LCFS). עם חשיפת ספרואידים של סרטן המעי הגס למינונים משתנים של LCFS, האינטראקציה עם מטבוליטים חיידקיים ב- LCFS גורמת לאפופטוזיס בתאי הסרטן, משבשת את המבנה הספרואידי ומובילה למוות תאי באופן תלוי מינון.

פרוטוקול

1. תרביות תאים חיידקיים והכנת סופרנאטנט ללא תאי לקטובצילוס (LCFS)

הערה: שלבים 1.2 – 1.9 מתבצעים בחדר אנאירובי.

1. הכינו צלחת אגר ומרק של דה מאן-רוגוזה-שארפ (MRS) המכילים L-ציסטאין ועיקרו על ידי אוטוקלאבינג.
2. לדגור מראש את צלחת אגר MRS בתא אנאירובי H₂ נשמר ב 37 ° C עם חמצן 20 ppm.
3. הפשירו מלאי חיידקי לקטובצילוס וחסנו את צלחת האגר בתרבית החיידקים (איור 1A (i)).
4. לדגור על חיידקים במשך 2-3 ימים בתא אנאירובי H₂ ב 37 ° C ו 20 ppm חמצן עד מושבות חיידקים בודדים מתקבלים.
5. לשטוף ולייבש את צינור תרבית אנרובי מסוג Hungate. Autoclave צינור התרבות ב 121 ° C במשך 15 דקות.
6. לאחר מכן לדגור על הצינור בתא אנאירובי H₂ ב 37 ° C ו 20 ppm חמצן כדי להסיר חמצן.
7. מניחים 2 - 3 מ"ל של מרק MRS לתוך הצינור. אטמו את הצינור עם פקק גומי בוטיל והבריגו את המכסה.
8. קבל מושבה אחת עם לולאה ומקם אותה לתוך צינור תרבית 1.5 מ"ל עם 500 μL של 1x PBS. (איור 1A (ii)).
9. השהו את המושבה באמצעות מזרק 1 מ"ל (איור 1A (iii)). עשה זאת על ידי, החדרת המחט של מזרק 1 מ"ל במרכז מכסה הצינור, שאיפה המושבה מרחפת ולאחר מכן להשעות אותו בחזרה לתוך מדיה מרק MRS. (איור 1A (iv)).
10. לדגור את מדיה מרק MRS באינקובטור שייקר במשך 2 ימים (37 ° C, 5% CO₂, 200 סל"ד).
11. מדוד את הצפיפות האופטית (OD) באמצעות ספקטרופוטומטר כדי לנטר את עקומות צמיחת החיידקים עד שהספיגה ב-OD₆₂₀ מגיעה ל-2.0.
12. יש להפריד בין כדוריות החיידקים לבין המצע המותנה על ידי צנטריפוגה במהירות של 1,000 x גרם למשך 15 דקות. יש לשטוף את כדורי החיידקים שנאספו עם 1x PBS ולהשהות מחדש ב-4 מ"ל של RPMI 1640 בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי. אין לכלול אנטיביוטיקה במדיום.
13. לשמור על כדורי החיידקים בסל"ד ולדגור באינקובטור שייקר במשך 4 שעות ב-37°C עם 5% CO₂ במהירות של 100 סל"ד.
14. להכנת הסופרנאטנט הפרוביוטי, יש להסיר את כדורית החיידקים באמצעות צנטריפוגה בטמפרטורה של 1000 x גרם, למשך 15 דקות בטמפרטורה של 4°C. סננו את הסופרנאטנט המשוחזר באמצעות מסנן של 0.22 מיקרומטר ואחסנו בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

2. דור של spheroids

1. הכנת שורות תאים של סרטן המעי הגס
   1. לגדל קווי תאים DLD-1, HT-29 ו-WiDr כחד-שכבות עד למפגש של 70-80% ולדגור על הצלחת ב-37°C באינקובטור 5%_CO2 (מדיום גידול: RPMI המכיל 10% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין).
   2. עבור תאים שגדלו בצלחת פטרי 100 מ"מ, שטפו את הצלחת פעמיים עם 4 מ"ל של 1x PBS. הוסף 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA ודגור על צלחת פטרי במשך 2 דקות ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂ כדי לנתק את התאים.
   3. לאחר הדגירה, לבדוק את דיסוציאציה התא תחת מיקרוסקופ ולנטרל טריפסין-EDTA עם 5 מ"ל של מדיום גידול.
   4. מעבירים את התאים המנותקים לצינור חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 3 דקות ב 300 x גרם.
   5. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש בעדינות עם 3 מ"ל של מצע צמיחה.
   6. ספור את התאים עם כחול טריפאן כדי לקבוע תאים קיימא באמצעות המוציטומטר. (איור 1B (i))
2. היווצרות כדורית
   1. בצינור חרוטי של 15 מ"ל, דללו את התאים מ-2.1.5 כדי לקבל 1-2 x 10⁵ תאים/מ"ל (איור 1B (ii))
   2. הוסף ריכוז סופי של 0.6% מתילצלולוז לתרחיף התא והעבר את התאים המדוללים למאגר סטרילי.
      הערה: עבור כל קו תאים, כמות המתילצלולוז הדרושה צריכה להיות טיטרציה ולהיקבע בהתאם.
   3. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי לחלק 200 μL של תאים לכל באר של חיבור נמוך במיוחד 96 באר עגול התחתון microplate. (איור 1B (iii))
   4. לדגור את הצלחת ב 37 ° C בחממה 5% CO₂ במשך 24 - 36 שעות.
   5. לאחר 24 - 36 שעות, התבונן בצלחת תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח היווצרות כדורית.

3. טיפול תלת ממדי בתאי סרטן המעי הגס עם LCFS

1. צור ספרואידים כמתואר בשלבים 2 ו-3.
2. לפני ביצוע טיפול LCFS, הפשיר את LCFS קפוא בטמפרטורת החדר (RT) במשך 10 - 20 דקות.
3. חסן את פתרון מניית LCFS למדיום צמיחה. דילול סדרתי ל 25%, 12.5% ו -6% במדיום הגידול (כלומר, 25% LCFS = 150 מיקרוליטר של מדיום גידול + 50 מיקרוליטר של LCFS).
4. מוציאים את צלחת תרבית התאים המכילה ספרואידים מהאינקובטור ומוציאים כמה שיותר ממדיום הגידול מכל באר באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר.
5. הוסף את מצע הגידול עם LCFS על התאים ודגר ב 37 ° C באינקובטור 5% CO₂ במשך 24 - 48 h.
   הערה: הנפח שישמש יהיה תלוי בגודל הצלחת כדלקמן: 2 מ"ל עבור לוחות תרבית תאים 6 בארות; 200 μL עבור לוחות תרבית תאים 96 באר.

תוצאות

איור 1: ייצוג סכמטי של היווצרות ספרואידים והכנת LCFS.

(A) תמונות ייצוג סכמטיות של פרוטוקול יצירת LCFS מסומנות על ידי (i-iv) (B) סכמות של היווצרות ספרואידים בתיווך מתילצלולוז מסומנות על ידי (i-iii).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
סרט הדבקה אופטי MicroAmp של Applied Biosystems	תרמו פישר סיינטיפיק	4311971	100 כיסויים
Axygen 2.0 מ"ל MaxyClear צינור מיקרוצנטריפוגה סנאפלוק, פוליפרופילן, שקוף, לא סטרילי, 500 צינורות/אריזה, 10 חבילות/מארז	קורנינג	SCT-200-C	500 צינורות/אריזה, 10 חבילות/מארז
BD Difco Bacto אגר	ב.ד.	214010	500 גרם
BD Difco Lactobacilli MRS מרק	ב.ד.	DF0881-17-5	500 גרם
קורנינג פוספט-באפר מלח, 1X ללא סידן ומגנזיום, PH 7.4 ± 0.1	קורנינג	21-040-CV	500 מ"ל
Falcon 5 מ"ל מבחנה תחתונה עגולה מפוליסטירן, עם מכסה הצמדה למסננת תאים	קורנינג	352235	25/חבילה, 500/מארז
סרום בקר עוברי, מאושר, מקור בארה"ב	תרמו פישר סיינטיפיק	16000044	500 מ"ל
לקטובצילוס פרמנטום	אוסף קוריאני לתרבויות טיפוס	KCTC 3112
L-ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט	סיגמא-אולדריץ'	C6852-25G	25 גרם
מתיל צלולוז (3500-5600mPa·s, 2% במים ב-20°C)	TCI	M0185	500 גרם
MicroAmp צלחת תגובה אופטית מהירה 96-Well עם ברקוד, 0.1 מ"ל	מערכות ביולוגיות יישומיות	4346906	20 צלחות
יחידת מסנן מזרקים Millex-GS, 0.22 מיקרומטר, אסטרי תאית מעורבים, 33 מ"מ, אתילן אוקסיד מעוקר	מיליפור	SLGS033SB	250
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)	תרמו פישר סיינטיפיק	15140122	100 מ"ל
RPMI-1640	גיבקו	11875-119	500 מ"ל
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדום	תרמו פישר סיינטיפיק	25200056	100 מ"ל
חומרים/ציוד/תוכנה
חממת CO2	דייג תרמי	HERAcell 150i
צינור חרוטי 15 מ"ל	SPL	50015
צינור חרוטי 50 מ"ל	SPL	50050
קורנינג קוסטאר חיבור אולטרה נמוך צלחת באר מרובה	סיגמא-אולדריץ'	CLS7007
קורנינג קוסטאר חיבור אולטרה נמוך צלחת באר מרובה	סיגמא-אולדריץ'	CLS3471
Costar 50 מ"ל מאגרי מגיבים, 5/Bag, סטרילי	כוכב משנה	4870
שקופיות תא ספירת תאים של רוזנת	תרמופישר	C10228
מונה תאים אוטומטי Countess II FL	Invitrogen	AMQAF1000
קורא EnSpire Multimode	פרקין אלמר		Enspire 2300
Eppendorf Research Plus פיפטה רב ערוצית, 8 ערוצים	אפנדורף	3122000051
שייקר מודגר	מלווה מעבדה	SIF-6000R
מד רב Ver. 3.0,	פוג'יפילם		טוקיו, יפן
צפיפות אופטית (OD)LAMBDA UV/VIS ספקטרופוטומטרים	פרקין אלמר		Waltham, MA, ארה"ב (ארצות הברית)
מיקרוסקופ ניגודיות פאזה	אולימפוס		טוקיו, יפן
צינור מיקרוצנטריפוגה SPL 1.5 מ"ל	SPL	60015
מאגרים רב ערוציים SPL, 12-Chs, PS, סטרילי	SPL	21012
מעבדי Vibra-Cell Ultrasonic נוזליים	תא SONICS-VIBRA	VC 505	מעבד קולי 500 וואט
תא ויניל אנאירובי	מוצרי COY LAB