פיתוח מודל עכבר אנושי עם תאי כבד אנושיים ותאי חיסון

Abstract

מקור: Dagur, R. S. et al., הקמת מודל עכבר TK-NOG אנושי כפול לפתוגנזה של כבד הקשור ל- HIV.J. Vis. Exp.(2019)

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת מודל עכבר כפול אנושי עם מערכת חיסון אנושית ותאי כבד. היא כרוכה בהשתלת תאי כבד אנושיים ותאי גזע ואב המטופויטיים בעכבר מהונדס מדוכאי חיסון באמצעות הזרקה תוך ספלנית, מה שמוביל לקליטת תאי כבד והתפתחות תאי חיסון אנושיים.

Protocol

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. עיבוד דם טבורי ובידוד תאי גזע/אב המטופויטיים אנושיים (HSPCs)

1. בצע את כל שלבי הפרוטוקול בתנאים סטריליים בארונות זרימה למינרית.
2. קח דם טבורי (CB) שנאסף בצינורות heparinized ולהפוך את נפח עד 35 מ"ל על ידי הוספת מלוחים חוצץ פוספט (PBS). שכבו את הדגימה על גבי מדיום הפרדת הלימפוציטים (LSM) כפי שמודגם באיור 1 וצנטריפוגו את ה-LSM עם CB שכבתי ב-400 x גרם למשך 35 דקות ב-4°C ללא בלמים.
   הערה: לדלל את הדם בזהירות ובעדינות כדי למנוע ערבוב בממשק.
3. הסירו בזהירות את שכבת ה-LSM והפלזמה העליונה והעבירו את ממשק המעיל הלבן לצינור חדש באמצעות פיפטת העברה.
4. השהה מחדש את מעיל באפי ב 30 - 40 מ"ל של חיץ קר כקרח (PBS + 0.5% אלבומין בסרום בקר [BSA] + 2 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה [EDTA]). באמצעות פיפטה, ערבבו 20 μL של תרחיף התא עם 20 μL של 0.4% טריפאן כחול ופיפטה 10 μL של התערובת לתוך הפתח החיצוני של אחד משני התאים של שקופית ספירה והכניסו את השקופית למונה תאים אוטומטי כדי לספור את התאים.
   הערה: השתמש במאגר קר כקרח בכל השלבים, מכיוון שהוא עוזר לשמור על התאים בני קיימא.
5. צנטריפוגו את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C ושאפו את supernatant בזהירות. לאחר מכן, הוסף 300 μL של חיץ קר כקרח.
6. הוסף 100 μL של מגיב חוסם קולטן Fc אנושי ו- 100 μL של מיקרו-כדוריות מצומדות נוגדנים CD34 נגד עכבר חד שבטי עבור עד 1 x 10⁸ תאים (ראה טבלת חומרים). לדגור במשך 30 דקות ב 4 ° C, להוסיף 10 מ"ל של חיץ קר כקרח כדי לשטוף את התאים, וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   הערה: שנה את קנה המידה בהתאם למספר התא אם קיימים יותר מ- 1 x 10⁸ תאים.
7. בזהירות להסיר את supernatant, להשעות מחדש את הגלולה ב 500 μL של חיץ, ולהמשיך עם שלב ההפרדה המגנטית כדי להעשיר HSPCs.
8. מקם עמודת LS עם בחירה חיובית (ראה טבלת חומרים) בשדה מיון התאים המופעל על ידי מגנטית והעבר אותה עם 3 מ"ל של חיץ.
9. טען את הדגימה לעמודת LS שיכולה ללכוד מיקרו-כדוריות הקשורות ל- CD34+ אנושי בדגימות ולאפשר לה לזרום תחת השפעת כוח הכבידה לתוך צינור האיסוף.
10. לשטוף את עמודה 3x עם חיץ ולאסוף את elute באותו צינור איסוף של CD34^- חלק של תאים.
11. צלל את העמודה עם 5 מ"ל של חיץ כדי להאיר את תאי CD34⁺ לתוך צינור איסוף חדש. חזור על ההליך כדי להשיג טוהר של >90%.
12. ספרו את תאי +CD34 המדוללים באמצעות צבע כחול טריפאן בהמוציטומטר. לאחר הספירה, צנטריפוגו את תאי CD34⁺ ב 300 x גרם במשך 5 דקות ולזרוק את supernatant.
13. השהה מחדש את תאי CD34⁺ ב 25 μL של PBS לזריקה לשימוש מיידי בהשתלה או בהקפאה של התאים בריכוז של 1-2 מיליון / מ"ל בתווך הקפאה (Roswell Park Memorial Institute medium [RPMI 1640 medium] + 50% נסיוב בקר עוברי (FBS) + 10% dimethyl sulfoxide [DMSO]) לשימוש נוסף בהשתלה.
    הערה: תמיד לספר תאים קיימא לפני השימוש בהם בהשתלה.
14. כדי לבדוק את טוהר CD34⁺ elute, לקחת 50 μL של התרחיף ולדגור אותו עם 10 μL של phycoerythrin או PE-conjugated נוגדן CD34 אנטי אנושי במשך 30 דקות ב 4 ° C. לאחר דגירה נוגדנים, לשטוף את התאים מוכתמים עם PBS, להשעות אותם מחדש ב 100 μL של PBS, ולאחר מכן, להמשיך לבצע ציטומטריה זרימה. הוסף צינור נוסף של תאים ללא נוגדן כדי לעצב את השער בציטומטר הזרימה.
15. לאחר הרכישה, נתח את הנתונים על-ידי בחירת אזור העניין בתרשים פיזור קדימה (FSC) ופיזור צדדי (SSC), ולאחר מכן גיוט עבור תאים בודדים בחלקות שטח FSC וגובה FSC. שער CD34 תאים חיוביים על תאים בודדים בערוץ PE ותרשים אזור SSC.

2. הכנת הפטוציטים האנושיים (HEPs) להשתלה

1. הסר את hepatocytes cryopreserved מן החנקן הנוזלי, במהירות לטבול את הבקבוקון באמבט המים, להפשיר כ 90 - 120 שניות.
2. הסר את מכסה בקבוקון ויוצקים את hepatocytes מופשר לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל של מדיום הפשרה מחומם.
3. להשעות את התאים על ידי נדנוד צינור 50 מ"ל ביד למשך כמה שניות.
   הערה: אין לערבל את הצינור.
4. מטילים את התאים על 100 x גרם במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את התאים הכדוריים ב-PBS עם 0.1% BSA ואגרו אותם ב-HSPCs טריים או מופשרים (יחס 10:1) ב-PBS בנפח סופי של 80 μL/עכבר.

3. טיפול, הקרנה, גנוטיפ וטיפול בבעלי חיים להשתלת HSPC והפטוציטים בבני אדם

1. טיפול בבעלי חיים
   1. כתוצאה מכשל חיסוני חמור, גזע, בית וטיפול בעכברי TK-NOG בתנאים אספטיים.
   2. תמיד ללבוש חלוק מעבדה, כפפות, כיסויי נעליים, ומסכת פנים כדי למנוע זיהום עם מיקרואורגניזמים פתוגניים פוטנציאליים.
   3. השתמשו בכפפות ובמכשירים סטריליים לניתוח וטפלו בבעלי החיים בצורה אספטית לאורך כל הניתוח.
2. בחירת עכברי TK-NOG לניסוי
   1. שמור על מושבת הזן TK-NOG על ידי גידול נקבות עכברי TK-NOG עם זכרים שאינם TK-NOG littermates ובחר צאצאים טרנסגניים על ידי genotyping.
      הערה: בצע גנוטיפ (ראה שלב 3.3) כדי לקבוע את נוכחותו או היעדרו של הטרנסגן בעכברים שזה עתה נולדו זכרים ונקבות בזמן הגמילה.
   2. גברים נבחרים בגיל 6 - 8 שבועות להשתלה בשל רגישותם הגבוהה לדלדול בתיווך GCV של הפטוציטים המבטאים טרנסגנים HSV-TK.
   3. יש לתייג את העכברים בזמן הגמילה או הניתוח כדי להקל על הזיהוי. שימו לב למשקל ולמצב הבריאותי של בעלי החיים.
3. גנוטיפ לנוכחות טרנסגן HSV-TK באמצעות תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז
   1. לבצע גנוטיפ בזמן הגמילה (בדרך כלל בגיל 3 - 4 שבועות). עבור גנוטיפ, לחתוך חתיכה מאוזן העכבר בארון בטיחות ביולוגי זרימה למינרית כדי לשמור על סטריליות ולחלץ DNA גנומי באמצעות ערכת בידוד DNA גנומי.
   2. להגביר את הדנ"א הגנומי המופק מחתיכת האוזן בתערובת תגובה של 20 μL כדי לסנן טרנסגן HSV-TK תחת בקרה של מקדם אלבומין אנושי על ידי הוספת 1 μL של פריימר קדמי 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL של פריימר הפוך 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0.5 μL של בדיקת FAM 5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3', ו-10 μL של תערובת מאסטר במכשיר תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (PCR).
   3. הגדר את הגדרות ה- PCR בזמן אמת באופן הבא: 60 ° C עבור 30 s (שלב קריאה מראש), 95 ° C למשך 10 דקות (שלב החזקה), 40 מחזורים של 95 ° C עבור 15 שניות ו- 60 ° C למשך דקה אחת (שלב PCR), ו- 60 ° C עבור 30 שניות (שלב לאחר הקריאה).
      הערה: מחזור של סף (Ct) מתחת ל-22 נחשב חיובי עבור טרנסגן HSV-TK.
4. טיפול באמצעות ganciclovir ו treosulfan
   1. באמצעות מחט 27 גרם, הזריקו לעכברי TK-NOG זריקות GCV תוך צפקיות (6 מ"ג/ק"ג) 2 פעמים ביום ביום 7 וביום 5 ב-100 מיקרוליטר מלח לפני ניתוח כדי לרוקן את התאים הפרנכימליים הטרנסגניים של העכברים (כפי שמוצג באסטרטגיית הניסוי באיור 2).
   2. בימים 3, 2 ו-1 לפני הניתוח, יש לבצע מצב מקדים לעכברים עם מינונים תוך-פריטוניאליים לא מיאלואבלטיביים של טראוסולפן (1.5 גרם/ק"ג/יום) ב-100 מיקרוליטר מלח, באמצעות מחט של 27 גרם.
   3. יום לפני הניתוח, יש לשאוב שתיים עד שלוש טיפות (~100 μL) של דם מהווריד התת-לסתני על ידי דקירתו עם שרוך 5 מ"מ, ולבודד את הסרום על ידי צנטריפוגה (1,500 x גרם למשך 10 דקות ב -4 מעלות צלזיוס) לבדיקת אלנין אמינוטרנספראז (ALT) כדי להעריך את מידת הנזק לכבד.
5. הכנה לניתוח
   1. השתמש בקוצץ כדי לגלח את פרוות העכבר המקיפה את אזור החתך (משמאל לדופן הצפק) לפני הניתוח.
   2. כוונן את זרימת החמצן ל-1 ליטר/דקה ואת זרימת האיזופלורן ל-3%-5% בתא אינדוקציה באמצעות מכונת הרדמה עכברית. הניחו עכבר אחד בכל פעם בתא הזירוז לצורך הרדמה.
   3. חבר את הקצה האחד של צינור מאריך סטרילי (עם קיבולת אחיזה של 550 מיקרוליטר של תרחיף; ראה את טבלת החומרים למפרט) למחט 30 גרם ואת הקצה השני למזרק 1 מ"ל.
   4. מלאו את המזרק בתרחיף (80 μL/עכבר) של HEPs ו-HSPCs (ראה סעיף 2), התאימו את המזרק לחריץ של פיפטת ניפוק חוזרת, וכווננו את המתקן כך שיפיץ 10 μL בכל לחיצה.
   5. לאחר שהעכברים מורדמים (בדרך כלל לאחר 3 - 4 דקות), מעבירים את זרימת האיזופלורן לקונוס האף ומפחיתים את קצב זרימת האיזופלורן ל 2% - 3%.
6. השתלה intrasplenic של HSPCs אנושיים hepatocytes בעכברים
   1. בצע את כל שלבי הניתוח בארון זרימה למינרי בתנאים סטריליים.
   2. מניחים וילון סטרילי נקי על משטח העבודה ומקרצפים את הצד השמאלי של הגוף של כל עכבר עם 10% פובידון-יוד ואחריו 70% אלכוהול איזופרופיל, לפני ביצוע חתך.
   3. בצע חתך קטן (~ 1 - 1.5 ס"מ אורך ו 5 מ"מ עומק) בעור, שריר, פריטוניום בצד שמאל של דופן הצפק עם מספריים מסוג Vanna להיכנס לחלל הצפק כ 5 מ"מ מתחת לקצה התחתון של כלוב הצלעות.
   4. אתר את הטחול, משוך אותו מעט עם מלקחיים לאזור הניתוח לגישה נוחה, והכנס את מחט 30 גרם לקוטב התחתון של הטחול.
   5. לפתוח את הבוכנה של פיפטה ניפוק ולחלק 10 μL של נפח בכל פעם, עם מגבלה של 60-80 μL לכל טחול. משכו את המחט באיטיות וחתכו את הטחול בעזרת אטבי קשירה באמצעות יישום קשירה.
   6. דחפו את הטחול חזרה לחלל הגוף בעזרת אפליקטורים עם צמר גפן שהורטבו ב-PBS סטרילי.
   7. סגור את שכבת השריר של דופן הבטן באמצעות תבנית תפר קטוע נספג (לא רציף). השג סגירת עור עם דפוס תפר קטוע באמצעות תפרים שאינם נספגים.

Results

איור 1: סכמטיות של העשרת תאי CD34⁺ מדם טבורי.(A) דם טבורי מונח בשכבות על מדיום הפרדת לימפוציטים (LSM) וצנטריפוגה כדי לבודד את הפרווה הבאפי. (B) עמודי LS מונחים על מעמד מגנטי ונשטפים בחיץ BSA, ולאחר מכן מוסיפים ציפוי באפי. תאים חיוביים עבור CD34 נלכדים בעמודות, ותאי CD34 מדוללים בצינורות נפרדים. תאי CD34⁺ לכודים בשרפי עמודות צוללים עם בוכנה, והתא...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מחטים בגודל 27G1/2"	BD biosciences	305109
מחטים בגודל 30G1/2"	BD biosciences	305106
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול 12 x 75 מ"מ סגנון	קורנינג	352054
BD 1 מ"ל מזרק שחפת ללא מחט	BD biosciences	309659
ביואנלייזר מערך BD FACS	BD Biosciences		לבדיקת טוהר של תאי CD34+ מדוללים
תוכנת מערך BD FACS	BD Biosciences		תוכנה לניתוח תא CD34+ שנרכש במערך FACS
פתרון BD FACS lysing	BD Biosciences	349202	כדי lyse כדוריות דם אדומות
BD LSR II	BD Biosciences		מכשיר לרכישת דגימות ציטומטריית זרימה
צינור איסוף דם פלסטיק BD Vacutainer	BD biosciences	BD 367874	לאיסוף דם טבורי
אלבומין בסרום בקר	סיגמא-אולדריץ'	A9576
ערכת CD34 MicroBead, אנושית	Miltenyi ביוטק	130-046-702	עבור isoation של CD34+ HSPC
CD34-PE, אנושי	Miltenyi ביוטק	130-081-002	נוגדנים המשמשים לבדיקת טוהר של תאי CD34+ מדוללים
שקופיות ספירת תאים	ביו-ראד	1450015
ערכת מיני רקמות gDNA של ChargeSwitch	תרמופישר מדעי	CS11204	להפקת DNA גנומי מהאוזן
אפליקטורים עם קצוות כותנה	מק'קסון	24-106-2S
DMSO (דימתיל סולפוקסיד)	סיגמא-אולדריץ'	D2650-5X5ML
סט הארכה Microbore Slide Clamp(s) קבוע זכר Luer Lock. אורך: 60 אינץ' אורך: 152 ס"מ PV: 0.55 מ"ל נתיב נוזלים סטרילי	BD biosciences	30914	מחובר לניפוק פיפט ולהעמסה עם HSPC ו- HEP suspesion
FACS Diva גרסה 6	BD Biosciences		תוכנת ציטומטר זרימה נדרשת לרכישת דגימה
סרום בקר עוברי (FBS)	גיבקו	10438026
תוכנת ניתוח FLOWJO v10.2	FLOWJO, LLC		תוכנה לניתוח ציטומטריה של זרימה
גנציקלוביר	APP Pharmaceuticals, Inc.	315110	תרופת פרסקריפיטיון
צינורות EDTA של Greiner MiniCollect	גריינר ביו-וואן	450475
הפשרת הפטוציטים בינונית	מעבדות מחקר משולשות	MCHT50
אופק פתוח Ligating קליפ Appliers	טלפלקס	537061	כדי להחזיק את תפסי הקשירה
הפטוציטים האנושיים	מעבדות מחקר משולשות	HUCP1	הפטוציטים האנושיים בהקפאה, אינדוקציה מוסמכת
איריס מספריים, ישר	טד פלה, בע"מ	13295
לנצט	מדיפוינט	גולדנרוד 5 מ"מ
עמודות LS	Miltenyi ביוטק	130-042-401	משמש ללכידת מיקרו-כדוריות CD34+ (ברירה חיובית)
מדיום הפרדת לימפוציטים (LSM)	MP Biomedicals	50494	עבור isoation של לימפוציטים מדם היקפי
MACS MultiStand	Miltenyi ביוטק	130-042-303	מחזיק מפריד Qudro MACS ועמודות LS
McPherson-Vannas מיקרו מנתח מספריים קפיץ	רובוז כלי ניתוח ושות'	RS-5605	משמש לביצוע חתך בעור לחשיפת הטחול
מיקרו מלקחיים מנתחים	רובוז כלי ניתוח ושות'	RS-5157	להחזיק ולשלוף טחול מחלל הצפק
עכבר CD45-FITC	BD Biosciences	553080	ספציפי לעכבר
PBS (מלח חוצץ פוספט)	היקלון	SH30256.02
מפריד Qudro MACS	Miltenyi ביוטק	130-090-976	מחזיק ארבע עמודות LS
סל"ד 1640 בינוני	גיבקו	11875093
StepOne Plus PCR בזמן אמת	מערכות ביולוגיות יישומיות		מכשיר המשמש לגנוטיפ
סדרת Stepper פיפטת חלוקה חוזרת 1ml	חברת דימקס	T15469	משמש לחלוקת מתלי HSPC ו- HEP באופן מבוקר
תמהיל מאסטר לביטוי גנים TaqMan	תרמופישר מדעי	4369016
מונה תאים אוטומטי TC20	ביו-ראד	1450102
עכברי TK-NOG			מסופק על ידי המכון המרכזי לחיות ניסוי (CIEA, יפן; ד"ר מאמורו איטו והירושי סואמיזו)
טרוסולפן	Medac GmbH		מסופק על ידי ד"ר יואכים באומגרט (medac GmbH)
כחול טריפאן	ביו-ראד	1450022
מספריים מיקרו מסוג Vannas, ישר, אורך 80 מ"מ	טד פלה, בע"מ	1346	משמש לביצוע חתך בעור לחשיפת הטחול
Weck hemoclip קליפ מסורתי טיטניום ligating קליפים	תפרים	523700	כדי לקשור את הטחול לאחר ההזרקה