טכניקה ליצירת תאי CAR T ספציפיים לאנטיגן

תקציר

מקור: Davidson, H. W., et al. ייצור יעיל של תאי T ציטוטוקסיים ראשוניים ספציפיים לאנטיגן בעכבר לצורך בדיקה תפקודית במודל אוטואימוניות של סוכרת. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים טכניקה ליצירת תאי T של קולטן אנטיגן כימרי ספציפי לאנטיגן (CAR) באמצעות התמרה רטרו-ויראלית. תאי מורין CD8+ T פעילים מתווספים לצלחת מיקרווול המצופה בשברי פיברונקטין רקומביננטיים. לאחר מכן מוצגים וקטורים רטרו-ויראליים המכילים RNA מהונדס המקודד קולטן אנטיגן כימרי ספציפי לאנטיגן (CAR), והלוחית עוברת צנטריפוגה כדי להקל על הטרנסדוקציה. לאחר הדגירה, התאים המומרים מבטאים CARs ספציפיים לאנטיגן על פני השטח שלהם.

פרוטוקול

1. יצירה ותיקוף של נוגדני Fab בעלי שרשרת יחידה (scFab)-CARs.

הערה: מכוניות מכילות בדרך כלל 3 תחומים קריטיים – תחום מיקוד אנטיגן, תחום ספייסר/טרנסממברנה ותחום איתות ציטופלזמי. התכנון המדויק של כל מכונית תלוי במטרה המיועדת, ולכן, מלבד התכונות העיקריות של המבנה הרלוונטי לדור הרטרווירוס, לא יתוארו בפירוט בפרוטוקול זה. העיצוב הכולל של המכוניות ששימשו למחקרים המתוארים להלן מוצג באיור 1. בקצרה, תחום המיקוד כולל את כל השרשרת הקלה והמשתנה ותחום CH1 של השרשרת הכבדה מהנוגדן החד-שבטי האב המקושר על ידי מקשר קשיח למחצה. תחום הספייסר/טרנסממברנה הוא מעכבר CD28, ותחום האיתות הוא מיזוג המכיל אלמנטים מעכבר CD28, CD137 (4-1BB) ו-CD247 (CD3ζ). יסודות אלה מורכבים על ידי הליכים סטנדרטיים של ביולוגיה מולקולרית כגון תגובת שרשרת פולימראז חפיפה (PCR), או סינתזה של "בלוק גנים" מתאים. פרטים על הדור של מכונית mAB287 כלולים Zhang et al. ניתן לקבל את רצפי cDNA מהמחברים על פי בקשה.

1. הרכבת מבנה הרכב
   1. סנתז בנפרד את נוגדן Fab בעל שרשרת אחת (scFab) ואת תחומי הספייסר/איתות המשולבים, והשתמש בטכניקת קשירה "3 נקודות" כדי להרכיב את המבנה הסופי (איור 1).
      הערה: דרישת המפתח עבור תוספת הרכב היא שהיא צריכה להכיל אתרי אנדונוקלאז הגבלת איגוף המאפשרים קשירה לווקטור הביטוי הרטרו-ויראלי PMSCV-IRES-GFP II (pMIG II), או נגזרת קשורה מתאימים גם כן.
2. אימות ביטוי פני השטח של CAR
   1. התמירו את תאי ההיברידיומה באמצעות חלקיקים רטרו-ויראליים שמקורם ב-pMIG II שנוצרו על ידי פרוטוקול סטנדרטי (למשל, Holst et al).
   2. הפעל ניתוח ציטומטריה של זרימה כדי לזהות את הביטוי של GFP מווקטור CAR.
   3. ביטוי פני השטח של ה-CAR של ההיברידיות המומרים באמצעות נוגדנים מסומנים כנגד שרשרת κ של העכבר (למשל, שיבוט RMK-45).
3. אימות ספציפיות הרכב
   1. לעורר את תאי היברידיומה מומרים עם אנטיגנים מתאימים הקשורים לצלחת או תאים. לאחר תרבית משותפת בן לילה לאסוף supernatants וציטוקינים מופרשים, ונבדק על ידי אנזים מקושר immunosorbent assay (ELISA).
      הערה: באופן אידיאלי, כל מכונית צריכה להיות מאומתת באופן עצמאי לפני השימוש בה להתמרה. בשלב זה, ניתן להשהות את הניסוי ולהפעיל אותו מחדש מאוחר יותר.

2. טרנספקציה של תאי יצרן נגיפיים (יום - 4 עד יום 3)

הערה: רטרווירוס מיוצר באמצעות תאי Phoenix-ECO (ראה טבלת חומרים). השתמש באמצעי זהירות מתאימים לייצור חומרים שעלולים להיות זיהומיים (רצוי לכלול ארון בטיחות ביולוגית ייעודי ברמה 2 (BSL-2) ואינקובטור נפרד לגידול תאים נגועים/מותמרים).

1. הפשרת תאי עוף החול (יום -4)
   1. הפשרה 2 x 10⁶ תאי פניקס-אקו. הרחב את מספר תאי הפניקס אם מתוכננות טרנסדוקציות מרובות.
   2. צלחת אותם צלחת תרבית רקמה 10 ס"מ עם 10 מ"ל של בינוני (מדיום הנשר של Dulbecco שונה (DMEM) המכיל 10% סרום עגל עוברי (FCS)).
2. מעבר תאי עוף החול (יום -3)
   1. יש להסיר את החומר הבינוני ולשטוף עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (DPBS) של Dulbecco.
   2. הוסף 3 מ"ל של 0.25% טריפסין ודגור ב 37 ° C תחת 10% CO₂ אטמוספירה במשך 3 דקות.
   3. קוצרים את התאים ואז גלולה על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 x גרם. צלחת מחדש תאים עם 10 מ"ל מדיום טרי לדגור ב 37 ° C.
3. הקרנה של תאי עוף החול (יום -1 אחר הצהריים)
   1. כדי למזער חלוקה נוספת של תאים, אספו תאי פיניקס כמתואר בשלב 2.2, השהו מחדש ב-5 מ"ל של תווך והקרינו תאי גמא על קרח (1000 rad).
      הערה: יש לנקוט משנה זהירות בעבודות קרינה כדי למנוע חשיפה של כוח אדם.
   2. צנטריפוגות את התאים המוקרנים, מרחפים מחדש בתווך טרי, צלחת ב 2 x 10⁶ תאים (ב 10 מ"ל של בינוני) / צלחת / CAR, ולדגור.
4. טרנספקציה (יום 0 - בוקר)
   1. שאפו את הסופרנאטנט מתאי פיניקס, שטפו עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), והוסיפו בזהירות 7 מ"ל של מדיום סרום מופחת (למשל, Opti-MEM) טיפה לדופן הצלחת כדי למנוע הפרעה לחד-שכבה. העברת תאים חזרה לאינקובטור.
   2. קח שתי שפופרות פוליפרופילן תחתונות עגולות של 14 מ"ל, והוסף 1.5 מ"ל של מדיום סרום מופחת לכל אחת. לצינור אחד, הוסף 40 μL של מגיב transfection (ראה את טבלת החומרים).
   3. לצינור השני, הוסף 15 מיקרוגרם של פלסמיד Ab-CAR (שנוצר בשלב 1) ו -5 מיקרוגרם של פלסמיד מעטפה ואריזה (5 מיקרוגרם pCL-Eco). יש לדגור על צינורות בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
   4. מוסיפים את תערובת מגיב הטרנספקציה משלב 2.4.2 טיפה לצינור השני מבלי ליצור מגע עם דפנות הצינור, ומערבבים על ידי פיפטציה של התמיסה למעלה ולמטה בעדינות 3 פעמים. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות לפחות.
   5. מוסיפים 3 מ"ל מהתערובת טיפתית לתאי הפניקס, ומניחים באינקובטור תרבית רקמה.
   6. לאחר 4-5 שעות להוסיף 1 מ"ל של FCS. תאי תרבית לילה ב 37 °C (77 °F).
5. שינוי בינוני (יום 1)
   1. הסר את הסופרנאטנט המכיל את קומפלקסי הפלסמיד/מגיב הטרנספקציה והשליך אותם בהתאם לנהלים מוסדיים לטיפול בחומר זיהומי. הוסיפו 4 מ"ל של תרבית טרייה שחוממה מראש לתאים.
6. וירוס קציר להתמרה (יום 2)
   1. אספו את התווך המכיל את הנגיף מתאי פיניקס בעזרת מזרק סטרילי, סננו (0.45 מיקרומטר) כדי להסיר שאריות פסולת תאים, ואספו בצינור חדש.
   2. הוסף מלאי רקומביננטי אנושי אינטרלוקין-2 (rhIL-2) לריכוז סופי של 200 יחידות בינלאומיות (IU)/מ"ל. השתמש בנגיף באופן מיידי לצורך התמרה (שלב 5.3). מוסיפים 4 מ"ל מדיום טרי לתאי הפניקס ומניחים באינקובטור.
7. איסוף וירוסים חוזר (יום 3)
   1. חזור על שלב 2.6, אך השליך את תאי הפניקס כפסולת זיהומית במקום להוסיף מדיום טרי. סופרנאטנט זה משמש בשלב 5.4.

3. בידוד והפעלה ראשוניים של תאי CD8 T (יום -1 עד יום 0)

הערה: בעבר, אספו תאי CD8 T מנקבות עכברים סוכרתיים לא שמנים (NOD) בגיל 4-5 שבועות, נקודת זמן לפני תחילת דלקת האיונים. טפל בכל העכברים בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). תאי CD8 T מועשרים מטחול באמצעות ערכת בחירה שלילית מסחרית.

1. ציפוי צלחות עם נוגדנים CD3 / CD28 (יום -1)
   1. הוסף 1 מ"ל של תערובת נוגדנים נגד עכבר CD3 ו- CD28 (שניהם ב 1 מיקרוגרם / מ"ל ב PBS) לכל באר של צלחת 24 בארות, ודגר ב 4 ° C במשך הלילה.
   2. למחרת, לשטוף את הצלחות עם 1 מ"ל של PBS סטרילי 3 פעמים לפני הוספת תאי CD8 T מורין (שלב 4.1).
      הערה: מספר הבארות שיש לצפות ישתנה עבור כל ניסוי, בהתאם למספר הכולל של תאי CD8 T מופעלים הנדרשים.
2. אוסף של splenocytes (יום 0)
   1. יש להרדים שתי נקבות עכברי NOD בגילאי 4-5 שבועות באמצעות שאיפת_CO2 ואחריה עריפת ראש. קצרו את הטחול והניחו אותו על מסננת תאים הספוגה ב-PBS של 10 מ"ל בצלחת תרבית תאים על הקרח.
   2. במכסה מנוע של תרבית תאים, חותכים כל טחול ל 3-5 חתיכות, לוחצים על רקמות עם בוכנה סטרילית של מזרק 3 או 5 מ"ל כדי להפריד בין שברי הטחול ולאפשר לתאים לעבור דרך רשת התיל.
   3. הסירו בעדינות תאי דם אדומים על ידי השעיה מחדש של הטחול במאגר ליזה של תאים אדומים מדוללים ביחס 1:4 (1 מ"ל של חיץ ליזיס ב-3 מ"ל PBS לטחול אחד), ודגרה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. לאחר מכן, לדלל 10 μL של תרחיף התא עם תמיסת צבע כחול טריפאן לספירת תאים עם המוציטומטר, ו pellet את שאר התאים על ידי צנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 7 דקות.
3. העשרת תאי CD8 T (יום 0)
   1. העשרת תאי CD8 T על ידי בחירה שלילית באמצעות ערכת בידוד תאי CD8 T עכבר, בהתאם להוראות היצרן.
      הערה: כדי להבטיח טוהר גבוה, תמיד עגלו כלפי מעלה את מספרי התאים בעת חישוב נפח נוגדן ביוטינילציה שיש להוסיף (למשל, השתמשו בנפח הריאגנטים המוצע עבור 10⁸ תאים עבור 9.1 x 10⁷ תאים מחושבים).
   2. יש להשהות כדורי תאים ב-400 מיקרוליטר חיץ ו-100 מיקרוליטר קוקטייל נוגדנים ביוטין ל-1 x 10⁸ תאים, לערבב היטב ולדגור במשך 5 דקות במקרר (4°C) כדי לאפשר קשירת נוגדנים.
   3. הוסף 300 μL של חיץ תיוג ו 200 μL של מיקרו-חרוזים אנטי ביוטין לכל 1 x 10⁸ תאים, לערבב היטב לדגור במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   4. בזמן ההמתנה לכריכת מיקרו-חרוזים, הגדירו את עמוד ההפרדה על המפריד. יש לשטוף את העמוד על ידי שטיפה עם 3 מ"ל של חיץ תווית.
   5. העבירו 1000 מיקרוליטר של תערובת חרוזים/תאים דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר לפני הטעינה על עמודת ההפרדה כדי להסיר צברי תאים. אספו את זרימת העמוד לתוך צינור 15 מ"ל מקורר מראש.
   6. לשטוף את העמוד לפי הוראות היצרן, איסוף כל השפכים לתוך אותו צינור. קבע את מספר התא (זהה לשלב 3.2.4) ואסוף באמצעות צנטריפוגה ב- 350 x גרם למשך 5 דקות. לשטוף את התאים על ידי resuspending ב 2 מ"ל של תווך תאי T שלם (RPMI-1640 המכיל FCS, 2-mercaptoethanol, rhIL-2 (200 U / mL), עכבר Interleukin-7 (mIL-7, 0.5 ng / mL), ITS, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) ו פניצילין-streptomycin) וצנטריפוגה ב 350 x גרם במשך 5 דקות.
   7. יש להשהות מחדש את התאים בתווך תאי T שלמים שחוממו מראש (37°C) בריכוז של 0.25-0.5 x 10⁶/mL.

4. הפעלת תאי T (יום 0 עד 2)

1. הוסף 2 מ"ל של תרחיף התא (0.25-0.5 x 10,⁶/מ"ל) לכל באר מצופה של צלחת 24 בארות מצופה נוגדנים CD3 / CD28 משלב 3.1.2. השתמש בתנועה מסתחררת כדי לחלק את התאים באופן שווה.
   הערה: הוסף את התאים באמצעות תנועה מסתחררת כדי לפזר אותם באופן שווה ולמזער את אפקטי הקצה. אם התאים מתקבצים לאורך קצה הבארות, הן קצב ההולכה והן יכולת הקיום של התא יפחתו.
2. כבקרה, צלחת את אותו מספר של תאי CD8 T לתוך באר אחת לא מצופה של הצלחת. לדגור על התאים ב 37 ° C באמצעות אינקובטור 10% CO₂ גז במשך 48 h.
   הערה: לאחר 48 שעות, ההפעלה יכולה להיות מאושרת באמצעות מיקרוסקופ; התאים המופעלים יהיו גדולים יותר מהתאים שלא נתקלו בנוגדנים נגד CD3 / CD28.

5. התמרה של תאי CD8 T מופעלים (ימים 1 עד 3)

NOTE: פרוטוקול זה משתמש בשיטת ספין-טרנסדוקציה. נדרשת צנטריפוגה עם רוטור מתנדנד החוצה ומתאמי צלחת תרבית רקמה המסוגלים לשמור על טמפרטורה פנימית של 37 מעלות צלזיוס. כדי להבטיח יעילות מרבית, ביום ההמרה לחמם מראש את הצנטריפוגה ל 37 מעלות צלזיוס לפני איסוף הנגיף.

1. הכנת לוחות מצופים שבר פיברונקטין אנושי (יום 1 עד יום 2)
   1. ביום הראשון, הוסף 0.5 מ"ל של פיברונקטין (50 מיקרוגרם / מ"ל ב- PBS) לבארות של צלחת בת 24 בארות, ודגר לילה ב 4 ° C.
      הערה: בדרך כלל, נדרשות שתי בארות מצופות פיברונקטין לכל צלחת של תאי פיניקס נגועים.
   2. ביום השני להסיר את תמיסת פיברונקטין ולהחליף עם 1 מ"ל של 2% אלבומין בסרום בקר (BSA) ב PBS. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי "לחסום" אתרי קשירה לא ספציפיים.
   3. לשטוף את בארות מטופל עם 1 מ"ל של PBS סטרילי. לאחר הסרת תמיסת הכביסה, הצלחת מוכנה לשימוש; לחלופין, ניתן לאטום ולאחסן בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבוע.
2. אוסף תאי CD8 T מופעלים (יום 2)
   1. קצרו את תאי CD8 T המופעלים, ספרו וחשבו את כדאיות התא באמצעות טריפאן כחול או מכשיר אוטומטי מתאים.
   2. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ולהשהות מחדש ב 5 x 10⁶ תאים קיימא / מ"ל עבור טרנסדוקציה. שמור על אליציטוט קטן של תאים בתרבית בתווך תאי T השלם באינקובטור CO₂ כדי לספק בקרה למיון תאים מופעל פלואורסצנטי עוקב של התאים המומרים (שלב 6).
      הערה: לאחר ההפעלה במשך 48 שעות, מספר התאים הכולל היה צריך לגדול בערך פי 1.5, ויש להם כדאיות גדולה מ -95%.
3. התמרה (יום 2)
   1. הוסף 100 μL של תרחיף תאי CD8 פעיל לכל באר (0.5 x 10⁶ תאים) לצלחת מצופה פיברונקטין . לאחר מכן הוסף 1.5-2 מ"ל של מדיום המכיל וירוס (משלב 2.6) לכל באר. ערבבו באמצעות תנועה מסתחררת כדי לפזר את התאים באופן שווה (איור 2).
   2. הניחו את הצלחת בשקית ניילון עם רוכסן ואטמו (כדי לספק בלימה משנית). צנטריפוגה ב 2000 x גרם במשך 90 דקות ב 37 ° C.
   3. מוציאים את הצלחת מהצנטריפוגה. בבטיחות הביולוגית, הארון הסיר בזהירות את שקית הניילון וודא כי החלק החיצוני של הצלחת אינו מזוהם עם כל מדיום.
   4. לאחר מכן העבירו את הצלחת לאינקובטור CO₂ הייעודי של 37 °C. לאחר 4 שעות, להסיר 1 מ"ל של המדיום מכל באר ולהחליף עם 1 מ"ל של תווך תא T שלם שחומם מראש. החלף את הצלחת באינקובטור CO₂.
      הערה: יש לטפל בכל המדיה מהתאים המומרים כפסולת זיהומית.

תוצאות

איור 1: סכמה של המבנה הרטרו-ויראלי של CAR. ה-CAR מורכב מתחום מיקוד הנגזר ממקטע Fab של נוגדן חד-שבטי מתאים לעכבר, ותחום ספייסר/עוגן ממברנה/איתות מעכבר CD28, CD137 ו-CD247. ה-cDNA הסינתטי מוכנס לווקטור הביטוי הרטרו-ויראלי pMIG-II. אתרי אנדונוקלאז הגבלה המשמשים ליצירת mAb287-CAR מוצגים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-מרקפטואתנול (50 מילימול)	גיבקו	21985-023	50 או"ם
5' מירוץ PCR	קלונטק	634859
נוגדנים CD28 נגד עכבר	eBioscience	14-0281-86	ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל
נוגדן CD3e נגד עכבר	eBioscience	145-2ג11	ריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מ"ל
ביוטין עכברוש נגד עכבר IFN-γ	BD Biosciences	554410	ריכוז עבודה של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל
BSA	סיגמא	A7030
ערכת Maxi-Prep ללא אנדו	קיאגן	12362
גנטמיצין	גיבקו	15750-060	סופי 50 מיקרוגרם/מ"ל.
FCS מנוטרל בחום	היקלון	SH30087.03	סופי 10% FCS
HEPES (100X)	גיבקו	15630-080	פי 1
אינסולין-טרנספרין-סלניום-אתנולמין (ITS 100x)	תרמופישר	51500056	הריכוז הסופי הוא 1x
ליפופקטמין 2000	Invitrogen	11668019
עמודות LS	Miltenyi ביוטק	130-042-401
מאגר הפרדות MACS	Miltenyi ביוטק	130-091-221
ערכת בידוד תאי T CD8a + עכבר	Miletenyi ביוטק Inc	130-104-075
ערכת בידוד תאי T CD8a + עכבר	Miltenyi ביוטק	130-104-075
Opti-MEM בינוני	תרמופישר	31985070
פניצילין-סטרפטומיצין (5000U/מ"ל)	תרמופישר	15070063	50 U/ml
תאי Phoenix-ECO	ATCC	CRL-3214
מלח חוצץ פוספט (PBS)	גיבקו	10010-023
pMIG II	אדג'ין	52107
PMSCV-IRES-GFP II	אדג'ין	52107
מאגר ליזה של תאים אדומים	סיגמא	₪1997
רטרונקטין	טאקרה	T100A	ריכוז עבודה של 50 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS
rhIL-2 (ריכוז מלאי 105 IU/ul)	פפרוטק	200-02	ריכוז סופי של 200IU/ml
rmIL-7 (ריכוז מלאי: 50ng/ul)	מו"פ	407-ML-005	ריכוז סופי של 0.5ng/ml
RPMI-1640	גיבקו	11875-093
מסננות תאים סטריליות	פישר סיינטיפיק	22-363-548
טריפל	גיבקו	12605-028