טיפול בפאגים נגד זיהום Pseudomonas aeruginosa בעוברים של דגי זברה

תקציר

מקור: Cafora, M., et al., A. Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2020)

הסרטון מדגים את טכניקת הטיפול בפאגים המכוונת לזיהום Pseudomonas aeruginosa בעוברים של דגי זברה סיסטיק פיברוזיס. טיפול בפאגים מפחית ביעילות את עומס החיידקים וממתן תגובות חיסוניות מעודדות דלקת בעוברים של דגי זברה CF הנגועים בחיידקים, מה שמוביל לירידה בקטלניות של עוברי CF.

פרוטוקול

1. מיקרו-הזרקה של עוברי דגי זברה עם חיידקים וקוקטייל פאגים

הערה: כדי לבצע זיהום מערכתי, על העובר להיות בעל זרימת דם שמתחילה בדרך כלל לאחר 26 hpf.

1. לאחר 26 hpf, עוברים dechorionate עם תמיסת pronase מוכן על ידי המסת אבקת pronase בתווך E3 בריכוז של 2 מ"ג / מ"ל. מרפטים בעדינות את העוברים כדי לשבור את הכוריון. יש להשליך את הפרונאז/E3 מדיום ולשטוף את הכלי מספר פעמים עם E3 טרי כדי להסיר את כל הפרונאז.
2. מרדימים עוברים של דגי זברה בתווך E3 המכיל טריקאין כ-5 דקות לפני הזרקות.
3. פיפטה את העוברים המורדמים לתוך המסלול מוכן בשלב 1. השתמש בקצה העמסת ג'ל דק כדי לרפד את העוברים במצב רוחבי.
4. לטעון מחט microinjection עם כ 5 μL של הכנת P. aeruginosa.
5. הכנס את המחט באופן דורסלי לנקודת ההתחלה של צינור Cuvier שם היא מתחילה להתפשט על שק החלמון. הזריקו נפח של 1-3 nL וודאו שהנפח מתרחב ישירות בתוך הצינור ונכנס למחזור הדם.
6. בערך לאחר כל 50 עוברים מוזרקים, יש להזריק טיפה של החיידק לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל עם PBS סטרילי של 100 מיקרוליטר כדי לבדוק אם נפח ההזרקה נשאר זהה. צלחת את החיסון על אגר LB (ראה טבלה 1) ב 37 ° C במשך הלילה כדי להעריך את CFU.
7. העבירו את העוברים המוזרקים בשתי צלחות פטרי נקיות עם מדיום E3 טרי + PTU (טבלה 1) ודגרו עליהם בטמפרטורה של 28°C.
8. בשתי נקודות זמן נבחרות: 30 דקות או 3 שעות לאחר הזרקת החיידק, מוציאים מהאינקובטור את אחת מצלחות הפטרי עם עוברים מוזרקי חיידקים ומיישרים אותם במסלול כמתואר ב-6.3 להזרקת קוקטייל הפאג'ים.
9. העמיסו מחט מיקרו-הזרקה בכ-5 מיקרוליטר של קוקטייל הפאגים (תערובת של ארבעה פאגים המדביקים את הזן PAO1) בקצה העמסת ג'ל דק וקיבעו אותו למיקרו-מזרק.
10. הזריקו את קוקטייל הפאגים בצינור של קיווייה של העוברים שהוזרקו בעבר עם חיידקים.
11. מעבירים את העוברים המוזרקים בשתי צלחות פטרי נקיות עם מדיום E3 טרי + PTU ודגורים עליהם בטמפרטורה של 28°C.

טבלה 1: הכנת פתרונות

פתרונות	הכנה
פתרון מלאי הרדמה פי 25	4 מ"ג/מ"ל טריקאין ב-H2O מזוקק.
פתרון עבודה בהרדמה 1X	לדלל ב- H2O מזוקק את תמיסת מלאי הטריקאין הכנה 25X כדי להגיע לריכוז 1X (0.16 מ"ג / מ"ל) טריקאין של H2O מזוקק.
CsCl d=1.3	20.49 גרם אינץ' 50 מ"ל TN
CsCl d=1.4	20.28 גרם אינץ' 50 מ"ל TN
CsCl d=1.5	34.13 גרם אינץ' 50 מ"ל TN
CsCl d=1.6	41.2 גרם ב 50 מ"ל של TN
E3 עובר בינוני לעובר דג זברה	1 L 1of E3 (לדלל את מלאי 50X עם H2O מזוקק) + 200 μl של 0.05% מתיל כחול . יש לאחסן ב-RT.
E3 עובר מלאי בינוני פתרון (50X)	73.0 גרם NaCl, 3.15 גרם KCl, 9.15 גרם CaCl2 ו-9.95 גרם MgSO4 ב-5 ליטר H2O מזוקק. יש לאחסן ב-RT.
ל.ב. אגר	10 גרם / ליטר טריפטון, 5 גרם / ליטר תמצית שמרים, 5 גרם / ליטר NaCl, 10 גרם / ליטר אגר
מרק LB	עבור 1L: 950 מ"ל H2O, 10 גרם טריפטון, 10 גרם NaCl, 5 גרם תמצית שמרים
PBST	PBS 1X + Triton X 1%
פתרון פיזיולוגי	0.9% NaCl
פתרון מלאי חוסם פיגמנטציה 10X	0.3 מ"ג/מ"ל אבקת פניל תיאוריאה (PTU) בתווך עובר E3 לעובר דג זברה
פתרון מלאי Pronase פי 5	5 מ"ג/מ"ל אבקת פרונאז בתווך עובר E3 לעובר דג זברה
מאגר TN	10 mM Tris HCl pH 8.0, 150 mM NaCl

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
בקטו אגר	ב.ד.	214010
הפוספט של דולבקו חצץ מלוחים PBS	סיגמא-אולדריץ'	D8537
אתיל 3-אמינובנזואט מתאן-סולפונט	סיגמא-אולדריץ'	886-86-2	שם נפוץ טריקאין
Femtojet Micromanipulator	אפנדורף	5247
מחטי מיקרו-הזרקה	מכשיר הרווארד
N-פנילתיאוריאה >=98%	אולדריץ'-P7629	103-85-5
פרונאז	סיגמא-אולדריץ'	9036-06-0
Z-MOLDS מיקרו-הזרקה	מכשירים מדויקים של Word