הזרקת פלזמה עשירה בטסיות דם לגיד אכילס חתך של חולדה

תקציר

מקור: Greimers, L., et al. השפעות פלזמה עשירה בטסיות אלוגניות (PRP) על תהליך הריפוי של גידי אכילס חתוכים של חולדות: תיאור מתודולוגי. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים טכניקה להזרקת פלזמה עשירה בטסיות דם (PRP) לגיד אכילס חתך של חולדות. קטע קטן נכרת מגיד אכילס של חולדה מושתלת, האתר נתפר, והחולדה מורשית להתאושש. במקביל, דם שלם נאסף מחולדה תורמת וצנטריפוגה כדי לקבל PRP, אשר לאחר מכן מופעל ומוזרק לאתר התפור של החולדה המקבלת כדי לגרום לתיקון גידים.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת בעלי חיים

1. השתמשו ב-132 חולדות ספראג-דולי זכרים בני חודשיים במשקל 320-450 גרם (120 חולדות לניסויים ו-12 חולדות לדגימת דם, איור 1). חמש עשרה חולדות לכל קבוצה הספיקו בחזקה של 0.8 (סיכוי של 80% למצוא מובהקות סטטיסטית אם האפקט שצוין קיים).
2. לשכן את כל החולדות בכלובים קלאסיים בתנאי בידוד במתקן קונבנציונלי המצויד בעמדת החתלה. יש לעודד רבייה במתלה IVC (כלוב מאוורר בנפרד), כאשר חולדות SPF (נטולות פתוגן ספציפי) נרכשות באופן ספציפי.
3. השתמש בתנאי הדיור הבאים: טווח טמפרטורות בין 19-24 °C; לחות יחסית: 40-60%; אוורור: תדירות חידוש האוויר: 10-15 לשעה; מחזור אור/חושך: 12 שעות-12 שעות.
4. יש לעקר את כל ציוד הכלוב ולהשתמש במצעים מוקרנים. הטמעה מערכתית של העשרת הכלובים על ידי הנחת מגשי קרטון סטריליים ומגבות בתוך הכלובים.
5. לאפשר גישה לאזור בתנאים מוגבלים: מעיל מעבדה חדש, מסכה, כפפות, הנעלה ומצנפת שיער בכניסה.
6. לבצע ניטור בריאות המושבה על חיות זקיף השוכנות על מצעים מלוכלכים מדי שנה, על פי המלצות פלאסה למתקנים קונבנציונליים. החזיקו ארבעה עד חמישה בעלי חיים בכל כלוב עם תזונה מוקרנת מתאימה וספקו מים חומציים עד לליביטום. יש לפקח מדי יום.
7. העברת חולדות שנבחרו להתערבות כירורגית בסינון כלובים עליונים לחדרי הניתוח שעתיים לפני הניתוח.

2. הליך כירורגי

1. הכינו את כלי הניתוח: מספריים עדינים, מהדק, שני מלחציים המוסטטיים ומחזיק מחט. במהלך כל ההליכים יש ללבוש כפפות, מסכה, מכסה מנוע ומעיל מעבדה.
2. חלקו את החולדות באופן אקראי לשתי קבוצות (PRP ותמיסת מלח).
3. הוציאו את החולדה מהכלוב ושקלו אותה. השתמשו בתגי אוזניים ממוספרים כדי לזהות את החולדות. כדי למנוע התייבשות של העיניים, מניחים טיפות מים על הקרנית.
4. מרדימים את החולדה תוך צפקית באמצעות קסילזין (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקטמין (80 מ"ג/ק"ג משקל גוף). הניחו את בעלי החיים תחת ניטור לבבי-נשימתי כדי לאשר את ההרדמה ולבדוק אם יש רפלקסים בעיניים.
5. יש להזריק 50 μL של buprenorphine תת עורית (0.01-0.05 מ"ג/ק"ג כל 8-12 שעות) באזור הצוואר כמשכך כאבים.
6. יש לגלח את הגפה האחורית השמאלית באמצעות מכונת גילוח חשמלית, לחטא אותה ב-3 קרצוף לסירוגין של תמיסת איזו-בטדין/אלכוהול (1:10 מדולל), ולהניח את החולדה על פד חם (20°C) תחת מיקרוסקופ מנתח. הניחו את החולדה על דקוביטוס לטרלי עם הרגל לניתוח במצב מעולה. החזק את הכף עם מלקחיים כירורגיים.
7. בעזרת המספריים, בצעו חתך רוחבי קטן (20-25 מ"מ) בעור המקיף את גיד אכילס השמאלי, ונתחו את הפאשיה באמצעות מספריים עדינים כדי לחשוף את קומפלקס גיד אכילס (איור 2a).
8. הסירו את גיד הפלנטריס בעזרת מספריים (איור 2b).
9. חותכים את גיד אכילס לרוחב 5 מ"מ פרוקסימלי להחדרתו הקלקניאלית ומוציאים חלק באורך 5 מ"מ באמצעות מספריים. אין לתפור את הגיד (איור 2c, 2d).
10. תפר את הפאשיה ואת העור עם חוט resorbable, עושה תפר overjet (תפר רציף). תפרי מונופילמנט יכולים גם למנוע פתיל מהעור לתוך החתך הניתוחי.
11. הניחו את החולדה מתחת למנורת חימום עד שהיא ערה, ואז החזירו אותה לכלוב (58X38 ס"מ) (Nota bene: לא מוטלת השתקה).

3. הכנת PRP

1. מרדימים את החולדות התורמות עם קסילזין (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקטמין (80 מ"ג/ק"ג משקל גוף) על ידי הזרקה תוך צפקית. הזרקת PRP מתבצעת שעתיים לאחר הניתוח ללא כל הרדמה חוזרת.
2. להזריק 50 μL של buprenorphine תת עורית כמו משכך כאבים.
3. איסוף דם שלם (20 מ"ל לחולדה, דימום סופי) על ידי ניקוב לב לתוך צינורות סטריליים המכילים 3.2% נתרן ציטראט חוצץ (0.109 M, נוגד קרישה). לאחר מכן, להרדים את החולדה על ידי הזרקה תוך לבבית.
4. כדי להשיג PRP, צנטריפוגה את הדם במשך 10 דקות ב 150 x גרם ובטמפרטורת החדר. שלב ראשוני זה של צנטריפוגה במהירות נמוכה מניב שני שלבים נפרדים: שלב תחתון המורכב מתאי דם אדומים (RBCs) המהווה כ-80-90% מהנפח הכולל ושלב עליון המורכב מפלזמה עשירה בטסיות (PRP) (בדרך כלל 10-20% מדגימת הדם).
5. לאסוף את PRP (השלב העליון) בצינור פלסטיק משני באמצעות פיפטה העברת פלסטיק. מכיוון שהממשק בין PRP לתאי דם אדומים רופף מאוד, אל תתקרבו יותר מדי לממשק. כאשר מטפלים כראוי, זיהום RBCs ב- PRP צריך להיות מתחת 0.05 x 10³ תאים / μL. יש להשליך את השלב התחתון הנותר ואת צינור איסוף הדם הראשוני.
6. לקבוע את נפח PRP שנאסף ולמדוד את ספירת טסיות על מנתח המטולוגי. ערכים אלה נדרשים לחישובים להתאמת ריכוז טסיות הדם בשלב הבא. ספירת תאי דם מועילה גם להערכת זיהום פוטנציאלי עם RBCs ו- WBCs. ריכוז טסיות הדם ב- PRP בשלב זה הוא בדרך כלל 1 – 1.5 x10⁶/μL.
7. בצע צנטריפוגה שנייה של PRP במשך 10 דקות ב 1,000 x גרם ובטמפרטורת החדר. צעד צנטריפוגה מהיר זה מניב גלולת טסיות רופפת וסופרנאטנט של פלזמה אוטולוגית ענייה בטסיות (PPP). באמצעות הערכים שנקבעו בשלב 3.6, חשב את נפח supernatant שיש לזרוק כדי לרכז את PRP ולהגיע לריכוז סופי של 2.5 x10⁶/μL.
8. אספו בעדינות את הסופרנאטנט (PPP) בצינור פלסטיק משני באמצעות פיפטת העברת פלסטיק, והשאירו כשני שלישים מהנפח הסופי מחושב בשלב 3.7. כאשר הגלולה רופפת, כמות משמעותית של טסיות הולכת לאיבוד כאשר PPP מושלכת, מה שעלול להפחית את הריכוז הרצוי.
9. בזהירות להשהות מחדש את גלולת טסיות הדם עם הסופרנאטנט שנותר על ידי פיפטינג עדין חוזר. מדוד את ספירת הטסיות על PRP מרוכז זה. במידת הצורך, הוסף את הנפח המתאים של PPP אוטולוגי כדי להגיע לריכוז היעד הסופי.
   הערה: השתמש PRP בתוך 3 שעות של הכנה.
10. הוסף 50 μL של CaCl₂ (11 mEq 10 מ"ל) לכל מ"ל של PRP כדי להפעיל את טסיות הדם.
11. הזריקו 50 μL של PRP טרי או תמיסת מלח עם מחט 21G ישירות לאתר הפעולה שנתפר כשעה לאחר ההכנה. במהלך תקופה זו, יש לשמור על PRP בטמפרטורת החדר.
12. עקוב מקרוב אחר ההתאוששות התפקודית של החולדות בימים שלאחר הניתוח ולפני הסרת גיד אכילס.

תוצאות

איור 1: תכנון ניסויי של המחקר.

איור 2: הליך כירורגי.

(a) מכלול הגידים לאחר הסרת הפאשיה שמסביב.

(b) הסרת גיד הפלנטריס.

(c) הסרת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קסילזין (Xyl-M)	VMD	ללא	הרדמה
קטמין (Jétamine 1000 CEVA)	CEVA Santé Animale	ללא	הרדמה
בופרנורפין (Vetergésic Multidosis)	אלסטו	ללא	משכך כאבים
איזו-בטאדין	מדה-פארמה	ללא	חומר חיטוי
חוט Resorbable Vicryl 6/0	ג'ונסון אנד ג'ונסון
נמבוטל	CEVA Santé Animale	ללא	הרדמה
פרפורמאלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 6148	משמר את מבנה הרקמה
איזופרופנול 100%	VWR	2,09,22,364
אתנול 95%	VWR	2,08,23,362
קסילן	VWR	28973.363
פרפין	VWR	LEIC3950.1006
המטוקסילין	מיליפור	1.15938.0025	צבען
אאוסין	מיליפור	1.15935.0100	צבען
יוקיט	סיגמא-אולדריץ'	3989	אמצעי הרכבה
CaCl2