$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. סינתזה של פולימר פולי(אסטרי אמינו בטא) (pBAE) עם אוליגופפטידים סופיים (OM-pBAE)
- פילמור של C6-pBAE
- הוסף 5-אמינו-1-פנטנול (38 מילימול; MW = 103.16 Da) 1-hexylamine (38 mmol; MW = 101.19 Da) לתוך בקבוק זכוכית עגול תחתית (100 מ"ל). לאחר מכן, להוסיף 1,4-butanediol diacrylate (82 mmol; MW = 198.22 Da).
- מחממים מראש את אמבט שמן הסיליקון ב 90 מעלות צלזיוס, מניחים את הבקבוק התחתון העגול לתוך אמבט השמן ומערבבים את התערובת בעזרת מוט ערבוב מגנטי למשך הלילה (~ 18 שעות). לאחר מכן, לקחת את המוצר מן בקבוק תחתית עגולה ומניחים אותו במקפיא ב -20 ° C.
הערה: המוצר הוא בצורה של אבקה דביקה והוא נלקח מן הבקבוק בעזרת מרית. זה חיוני כדי לאמת את המבנה של פולימר המתקבל באמצעות 1H-NMR. ספקטרום NMR תועד במכשיר של 400 מגה-הרץ (ראו טבלת חומרים) תוך שימוש בכלורופורם-d ו-D2O כממסים. כ -10 מ"ג מכל פולי(β-אסטר אמינו) נלקחו והומסו ב -1 מ"ל של הממס המפורק.
- תגובה עם פפטידים להשגת OM-pBAE
- הוסף 25 מ"ל של 0.1 M HCl לפפטידים נבחרים, למשל, פפטיד Cys-His-His-His עם חומצה טריפלואורואצטית (TFA, 200 מ"ג), לתוך צינור צנטריפוגה ששקל בעבר 50 מ"ל שיכול לעמוד לייבוש בהקפאה ולערבב ידנית במשך הלילה כדי לקבל פתרון ברור.
- להקפיא את התמיסה ב -80 ° C למשך 1 שעה ולהקפיא לייבש את הפפטיד הידרוכלוריד וכתוצאה מכך.
הערה: בדוק אם המשקל הסופי תואם את הערך התיאורטי.
- הפוך פתרון של C6-pBAE (0.031 mmol) ב dimethyl sulfoxide. כמו כן, לעשות פתרון של פפטיד hydrochloride (0.078 mmol) ב dimethyl sulfoxide.
- מערבבים את שתי התמיסות בצינור מכסה בורג ומברגים על המכסה. ערבבו את תמיסת התערובת באמבט מים בטמפרטורה מבוקרת של 25°C למשך 20 שעות בעזרת מוט ערבוב מגנטי.
- הוסיפו את התערובת ל-7:3 (v/v) דיאתיל אתר/אצטון. צנטריפוגה את המתלה שנוצר ב 25,000 x גרם ב 4 ° C כדי להסיר את הממס. לאחר מכן, שטפו את המוצק עם 7:3 (v/v) אתר דיאתיל/אצטון פעמיים. לאחר מכן, יבש את המוצר תחת ואקום (<0.2 אטמ').
- הפוך פתרון של 100 מ"ג / מ"ל של המוצר dimethyl sulfoxide. המוצר המתקבל נקרא C6-peptide-pBAE. זה חיוני כדי לאמת את המבנה של פולימר המתקבל באמצעות 1H-NMR כדי לאשר את היעלמותם של אותות olefin הקשורים acrylates טרמינל. אם לא נעשה שימוש, ניתן להקפיא את הפולימר ב -20 °C.
2. היווצרות פוליפלקסים
הערה: כל ההליכים צריכים להתבצע בתוך חדר ממוזג כדי לשמור על טמפרטורה קבועה.
- הפשירו את הפולימרים C6-peptide-pBAE ומערבלים את התמיסה.
- פיפטה הפולימר מערבבים למעלה ולמטה ומכינים תמיסה של 12.5 מילימטר (V1) בנתרן אצטט (NaAc). לאחר מכן, מערבלים את התערובת ומחכים 10 דקות.
- מכינים את החומצה הריבונוקלאית שליח (mRNA) ב 0.5 מ"ג / מ"ל ומערבבים על ידי pipetting (V2).
הערה: חשוב להימנע מערבולות ה-mRNA.
- מערבול תערובת הפולימרים בריכוז הסופי כדי להשיג תמיסה הומוגנית בין מלאי הפולימרים בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) לבין מאגר האצטט.
הערה: ריכוז הפולימר הסופי תלוי ביחס N/P (קבוצות חנקן לפוספט) שנבחר. יחס N/P תלוי בכל mRNA ספציפי שיש להשתמש בו. עבור אנקפסולציה משופרת של חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP), למשל, נעשה שימוש ביחס של 25:1, כפי שדווח בעבר.
- מערבבים את תמיסת החומר הגנטי ותמיסת C6-peptidepBAE (פי 25 מריכוז ה-mRNA) ביחס של 1:1 (Vi = V1 + V2).
הערה: C6-peptide-pBAE נטען בצינור מיקרוצנטריפוגה שבו מוסיפים את ה-mRNA על ידי צנרת למעלה ולמטה לצורך ערבוב. לאחר ההכנה, הפוליפלקס, חומצת הגרעין, וריכוזי C6-peptide-pBAE מדוללים למחצה.
- יש לדגור בטמפרטורה של 25°C למשך 30 דקות בבלוק תרמי. זרז עם מים נטולי 1:2 RNase על ידי הוספת הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה טעון מראש עם מים.
- כלול את החומרים הפעילים. הוסף את אותו נפח כמו תערובת של mRNA ו- pBAE (Vi) בחומצה 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזיןאתאןסולפוני (HEPES) 20 mM וסוכרוז 4% על ידי פיפטציה למעלה ולמטה. בשלב זה, הדגימה דוללה פי 3.
3. פוליפלקסים ליופיליזציה
- באופן מיידי, מקפיאים במקפיא -80°C של תמיסת הפוליפלקס הקודמת למשך שעה אחת.
- בצע את הייבוש העיקרי על-ידי ביצוע השלבים: (1) שעה אחת ב- -60°C ו- 0.001 hPa; (2) שעה אחת ב-40°C ו-0.0001 hPa; (3) 4 שעות ב-20°C ו-0.0001 hPa; (4) 12 שעות ב-5°C ו-0.0001 hPa.
- יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C באופן מיידי כדי למנוע התייבשות עד לשימוש.