טיהור ננו-חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

תקציר

מקור: Karch, C. P. et al., ייצור ננו-חלקיקי חלבון E. coli-ביטוי עצמי הרכבה עצמית עבור חיסונים הדורשים הצגת אפיטופ טרימרי.J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מציג את הטיהור של ננו-חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית או SAPN המתויגים בהיסטידין באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית של זיקה. שברי SAPN מטוהרים המתקבלים מתאימים לפיתוח חיסונים, וטומנים בחובם הבטחה ליישומים אימונותרפיים פוטנציאליים.

פרוטוקול

1. ביטוי ליבת ננו-חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית המכילה צרור בעל שישה סלילים (SHB-SAPN) חלבון בחלבון E. coli BL21(DE3)

1. יש לערבב 95 מ"ל של רכיב A ו-5 מ"ל של רכיב B של המדיה בבקבוק Erlenmeyer זכוכית סטרילית בנפח 2 ליטר בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). הוסיפו אמפיצילין לריכוז סופי של 100 מק"ג/מ"ל.
2. חסן את התקשורת עם E. coli מתרבית מלאי גליצרול שהוקמה בעבר. יש לדגור על תרבית בטמפרטורה של 30°C עם טלטול ב-200 סיבובים לדקה (סל"ד) למשך 48 שעות
   הערה: מלאי E. coli BL21 (DE3) המשומש הכיל את וקטור הביטוי העמיד לאמפיצילין עם הגן SHB-SAPN. למרות הפרוטוקול הכללי של התקשורת ממליץ 24 שעות של דגירה ב 37 ° C, 48 שעות של דגירה ב 30 ° C נותן תשואה גבוהה יותר עבור SHB-SAPN.
3. מעבירים את התרבית לשני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל. צנטריפוגה את הצינורות ב 4,000 x גרם במשך 10 דקות עם רוטור זווית קבועה ב 4 ° C. להסיר את supernatant ולשמור את הגלולה כדי לקצור תאים.
   הערה: ניתן לעבד את גלולת התא באופן מיידי או להקפיא אותה בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

2. ליזה של E. coli BL21(DE3) על ידי סוניקציה

הערה: יש להשתמש בכלי פלסטיק לא פירוגניים ובכלי זכוכית האפויים בטמפרטורה של 250°C למשך 30 דקות לפחות. Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP), כחומר מחזר, שובר את הקשרים דיסולפידים בתוך ובין חלבונים. TCEP הכרחי עבור המאגרים במהלך פרוטוקול זה אם האנטיגן המוצג מכיל קשרי S-S. עבור ליבת SHB-SAPN בלבד, נוכחות TCEP במאגרים אינה חיונית.

1. הכינו חיץ נטול אימידזול (8 M Urea, 50 mM נתרן פוספט מונובייסיק, 20 mM בסיס Tris, 5 mM TCEP) pH 8.0 (מותאם עם 5 N נתרן הידרוקסיד, NaOH) וסנן אותו באמצעות יחידת סינון בקבוקי ואקום 0.22 מיקרומטר.
2. השהה מחדש את התאים הכדוריים (משלב 1.3) עם 40 מ"ל של חיץ ללא אימידזול בצינור חרוטי אחד של 50 מ"ל. סוניק את התאים המרחפים מחדש עם גשושית על קרח למשך 5 דקות (4 שניות של סוניקציה, 6 שניות של מנוחה) עם פלט סוניקציה של 150 W.
3. צנטריפוגה את הליזט התאי (40 מ"ל) ב 29,000 x גרם ב 4 ° C במשך 25 דקות ברוטור זווית קבועה כדי ליצור supernatant בהיר. מעבירים את הסופרנאטנט לבקבוק סטרילי בנפח 150 מ"ל ומשליכים את הכדורית. לדלל את supernatant ל 100 מ"ל באמצעות חיץ ללא imidazole (מאוחר יותר בפרוטוקול המכונה "דגימה").
   הערה: שלב דילול זה נחוץ כדי למנוע מלחץ מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית (FPLC) בעל הביצועים המהירים להפוך גבוה מדי במהלך טעינת ליזט על העמודה.

3. טיהור חלבונים באמצעות העמודה שלו

NOTE: פרוטוקול זה בוצע באמצעות מכשיר FPLC, אך ניתן להתאים אותו לזרימת הכבידה.

1. הכן את המאגרים הבאים וסנן אותם באמצעות יחידת סינון בקבוקי ואקום 0.22 מיקרומטר: (i) חיץ ללא אימידזול "Buffer A" (8 M Urea, 50 mM נתרן פוספט monobasic, 20 mM בסיס Tris, 5 mM TCEP) pH 8.0; (ii) 500 mM imidazole חיץ "חיץ B" (8 M Urea, 50 mM נתרן פוספט monobasic, 20 mM בסיס Tris, 5 mM TCEP, 500 mM Imidazole) pH 8.0; ו-(iii) שטיפת איזופרופנול (20 מ"מ טריס, 60% איזופרופנול) pH 8.0.
   הערה: pH עבור כל מאגר הותאם עם 5 N NaOH.
2. שיווי משקל של His-column.
   הערה: לייצור בקנה מידה של מעבדה, פרוטוקול זה משתמש בעמודת His ארוזה מראש של 5 מ"ל, אך ניתן להשתמש בכל עמודה בגודל גדול יותר.
   1. פתח את תוכנת FPLC ולחץ על שיטה חדשה אופציה. זה ייפתח מיד לתפריט הגדרות השיטה. תחת התפריט הנפתח עבור מיקום עמודה, בחר C1 יציאה 3.
   2. בתפריט הנפתח מוצג על-ידי טכניקה, בחר אהדה. בתפריט הנפתח סוג עמודה בחר אחרים, Histrap HP, 5 מ"ל. נפח העמודות ותיבות הלחץ יוגדרו באופן אוטומטי לערכים המתאימים.
   3. לחץ על כפתור המתאר של השיטה. גררו את הלחצנים הבאים מהתפריט הקופצני של ספריית השלבים: שיווי משקל, יישום לדוגמה, שטיפת עמודות ו-elution ליד החץ בסדר זה בדיוק. סגור את תפריט ספריית השלבים.
   4. לחץ על כפתור שיווי המשקל. הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר ראשוני B" (4%), "מאגר סופי B" (4%) ו- "נפח (CV)" 5.
   5. לחץ על התיבה יישום לדוגמה. בתיבת טעינת הדגימה, לחץ על לחצן האפשרויות עבור הזרקת דגימה בעמודה עם משאבת הדגימה. ודא שהתיבה לצד השתמש בקצב זרימה מהגדרות השיטה מסומנת בתיבה הזרקת דגימה עם משאבת מערכת. לצד תיבת עוצמת הקול בצד ימין של המסך, שנה את הערך ל- 20 מ"ל.
   6. לחץ על כפתור שטיפת עמודות. הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר ראשוני B" (4%), "מאגר סופי B" (4%) ו- "נפח (CV)" 5. לצד ערכת איסוף השברים, בטל את הלחיצה על התיבה הפוך לזמין.
   7. לחץ על כפתור elution. הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר ראשוני B" 0%, "מאגר סופי B" 100% ו- "נפח (CV)" 5. לצד ערכת איסוף השברים, לחץ על התיבה אפשר. בטל את לחיצה על השתמש בגודל שבר מהגדרות השיטה והתאם את גודל השבר ל- 4 מ"ל בתיבת המילוי שלהלן.
   8. לחץ על הלחצן שמור בשם בחלק העליון של התוכנה. תן לקובץ את השם "שיווי משקל".
   9. חבר את העמודה שלו ארוזה מראש של 5 מ"ל ליציאת העמודה המתאימה 3 ב- FPLC. גם משאבה A וגם משאבה B צינור, כמו גם צינורות משאבת הדגימה, צריכים להיות ממוקמים לתוך 0.22 מיקרומטר מים מסוננים deionized. הפעל את תוכנית שיווי המשקל.
   10. הכניסו הן את משאבה A והן את משאבה B, כמו גם את צינור המשאבה לדוגמה, לתוך המאגר נטול האימידזול (Buffer A) והפעילו שוב את פרוטוקול שיווי המשקל.
3. קושרים את הדגימה לעמודה ומטהרים את החלבון.
   1. פתח את תוכנת FPLC ולחץ על שיטה חדשה אופציה. זה ייפתח מיד לתפריט הגדרות השיטה. תחת התפריט הנפתח עבור עמודה, מיקום בחר יציאה C1 3. בתפריט הנפתח מוצג על-ידי טכניקה, בחר אהדה. בתפריט הנפתח סוג עמודה בחר אחרים, Histrap HP, 5 מ"ל. נפח העמודות ותיבות הלחץ יוגדרו באופן אוטומטי לערכים המתאימים.
   2. לחץ על כפתור המתאר של השיטה. גררו את הלחצנים מהתפריט הקופצני של ספריית השלבים: שיווי משקל, יישום לדוגמה, שטיפת עמודות (Wash 1), שטיפת עמודות (Wash 2), שטיפת עמודות (Wash 3) ו-Elution ליד החץ בסדר זה בדיוק. סגור את תפריט ספריית השלבים.
   3. לחץ על כפתור שיווי משקל. הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר ראשוני B" 4%, "מאגר סופי B" 4% ו- "נפח (CV)" 5.
   4. לחץ על התיבה יישום לדוגמה. בתיבת טעינת הדגימה, לחץ על לחצן האפשרויות עבורדוגמת I nject בעמודה עם משאבת הדגימה. ודא שהתיבה לצד השתמש בקצב זרימה מהגדרות השיטה מסומנת בתיבה הזרקת הדגימה עם משאבת המערכת.
   5. לצד תיבת עוצמת הקול בצד ימין של המסך, שנה את הערך ל- 100 מ"ל. לצד ערכת איסוף השברים, לחץ על לחצן הפעל. בטל את לחיצה על השתמש בגודל שבר מהתיבה הגדרות השיטה ולאחר מכן שנה את גודל השבר ל- 4 מ"ל.
   6. לחץ על כפתור שטיפת העמודה הראשונה (Wash 1). הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר ראשוני B" 4%, "מאגר סופי B" 4% ו- "נפח (CV)" 10. לצד ערכת איסוף השברים, לחץ על התיבה הפוך לזמין. בטל את לחיצה על השתמש בגודל שבר מהגדרות השיטה ולאחר מכן שנה את גודל השבר ל- 4 מ"ל.
   7. לחץ על כפתור שטיפת העמודה השנייה (כביסה 2). הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר ראשוני B" 0%, "מאגר סופי B" 0% ו- "נפח (CV)" 5. לצד ערכת איסוף השברים, לחץ על התיבה הפוך לזמין. בטל את לחיצה על השתמש בגודל שבר מהגדרות השיטה ולאחר מכן שנה את גודל השבר ל- 4 מ"ל.
   8. לחץ על כפתור שטיפת העמודה השלישית (Wash 3). הערכים המפורטים בטבלה צריכים להיות "מאגר ראשוני B" 0%, "מאגר סופי B" 0% ו- "נפח (CV)" 5. לצד ערכת איסוף השברים, לחץ על הפוך לזמין. בטל את לחיצה על השתמש בגודל שבר מהתיבה הגדרות השיטה ולאחר מכן שנה את גודל השבר ל- 4 מ"ל.
   9. לחץ על כפתור Elution. בטבלה השמאלית, לחץ על המידע המופיע ובתפריט שמופיע, לחץ על שלב המחיקה. גרור את לחצן מעבר הצבע האיזוקרטי לטבלה פעמיים כך שיהיו שני ערכים.
   10. הערך עבור הערך הראשון צריך להיות "מאגר ראשוני B" 30%, "מאגר סופי B" 30%, ו "נפח (CV)" 10. הערך עבור הערך השני צריך להיות "מאגר ראשוני B" 100%, "מאגר סופי B" 100%, ו "נפח (CV)" 10. לצד ערכת איסוף השברים, לחץ על לחצן הפעל. לחץ על התיבה לצד השתמש בגודל שבר מהגדרות השיטה.
   11. לחץ על להציל כפתור בחלק העליון של התוכנה. תן שם לקובץ "טיהור". משאבה צינור A של FPLC צריך להיות ממוקם לתוך מאגר כביסה ללא imidazole, בעוד צינור משאבה B צריך להיות ממוקם לתוך 500 mM imidazole חיץ 500 mM. צינור משאבת הדגימה צריך להיות ממוקם לתוך מדגם 100 מ"ל.
   12. הפעל את תוכנית "טיהור" והמתן לזמן שבו יש צורך באיזופרופנול 60% (לשטוף 2). השהה את התוכנית; יש להעביר את המשאבה: צינור מהשטיפה נטולת האימידזול לשטיפת איזופרופנול 60%. הפעל מחדש את התוכנית.
   13. לאחר השלמת שלב האיזופרופנול, השהה שוב את התוכנית ועבור לשאוב צינור A בחזרה למאגר השטיפה נטול האימידזול. הפעל מחדש את תוכנית הטיהור (שאר ההפעלה אוטומטית).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-פרופנול	פישר	BP26181	4 ליטר
אמפיצילין	פישר	BP1760-25	25 גרם
קורנינג מסנן ואקום/מערכות אחסון חד פעמיות	פישר	09-761-108	מגוון גדלים
GE Healthcare 5 מ"ל HisTrap עמודים ארוזים מראש של HP	GE HealthCare	45-000-325	5 יח'
גליצרול	פישר	BP229-4	4 ליטר
אימידזול	פישר	O3196-500	500 גרם
Magic Media E. coli ביטוי בינוני	תרמופישר	K6803	1 ליטר
מזרק סטרילי MilliporeSigma Millex 0.22 מ"מ מסננים	מיליפור	SLGV033RB	250 יח'
ירייה אחת כוכב BL21 (DE3) E. coli מוכשר מבחינה כימית	תרמופישר	C601003	20 בקבוקונים
נתרן פוספט מונובייסיק	פישר	BP329-500	500 גרם
בסיס טריס	פישר	BP152-1	1 ק"ג
אוריאה	פישר	BP169-500	2.5 ק"ג
ציוד
רוטור פיברלייט F14-14 x 50cy בזווית קבועה	תרמופישר	096-145075	רוטור
מערכת הכרומטוגרפיה NGC Quest 10	BioRad	7880001	FPLC לסיוע בטיהור חלבונים
סוניפר 450	ברנסון	ידוע גם בשם 096-145075	סוניקטור