טיהור ננו-חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

Abstract

מקור: Karch, C. P. et al., ייצור ננו-חלקיקי חלבון E. coli-ביטוי עצמי הרכבה עצמית עבור חיסונים הדורשים הצגת אפיטופ טרימרי.J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מציג את הטיהור של ננו-חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית או SAPN המתויגים בהיסטידין באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית של זיקה. שברי SAPN מטוהרים המתקבלים מתאימים לפיתוח חיסונים, וטומנים בחובם הבטחה ליישומים אימונותרפיים פוטנציאליים.

Protocol

1. ביטוי ליבת ננו-חלקיקי חלבון בהרכבה עצמית המכילה צרור בעל שישה סלילים (SHB-SAPN) חלבון בחלבון E. coli BL21(DE3)

1. יש לערבב 95 מ"ל של רכיב A ו-5 מ"ל של רכיב B של המדיה בבקבוק Erlenmeyer זכוכית סטרילית בנפח 2 ליטר בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים). הוסיפו אמפיצילין לריכוז סופי של 100 מק"ג/מ"ל.
2. חסן את התקשורת עם E. coli מתרבית מלאי גליצרול שהוקמה בעבר. יש לדגור על תרבית בטמפרטורה של 30°C עם טלטול ב-200 סיבובים לדקה (סל"ד) למשך 48 שעות
   הערה: מלאי E. coli BL21 (DE3) המשומש הכיל את וקטור הביטוי העמיד לאמפיצילין עם הגן SHB-SAPN. למרות הפרוטוקול הכללי של התקשורת ממליץ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-פרופנול	פישר	BP26181	4 ליטר
אמפיצילין	פישר	BP1760-25	25 גרם
קורנינג מסנן ואקום/מערכות אחסון חד פעמיות	פישר	09-761-108	מגוון גדלים
GE Healthcare 5 מ"ל HisTrap עמודים ארוזים מראש של HP	GE HealthCare	45-000-325	5 יח'
גליצרול	פישר	BP229-4	4 ליטר
אימידזול	פישר	O3196-500	500 גרם
Magic Media E. coli ביטוי בינוני	תרמופישר	K6803	1 ליטר
מזרק סטרילי MilliporeSigma Millex 0.22 מ"מ מסננים	מיליפור	SLGV033RB	250 יח'
ירייה אחת כוכב BL21 (DE3) E. coli מוכשר מבחינה כימית	תרמופישר	C601003	20 בקבוקונים
נתרן פוספט מונובייסיק	פישר	BP329-500	500 גרם
בסיס טריס	פישר	BP152-1	1 ק"ג
אוריאה	פישר	BP169-500	2.5 ק"ג
ציוד
רוטור פיברלייט F14-14 x 50cy בזווית קבועה	תרמופישר	096-145075	רוטור
מערכת הכרומטוגרפיה NGC Quest 10	BioRad	7880001	FPLC לסיוע בטיהור חלבונים
סוניפר 450	ברנסון	ידוע גם בשם 096-145075	סוניקטור