יצירת בועיות קרום פלזמה מתאי גזע מח עצם

Abstract

מקור: Xu, L. et al., הכנת שלפוחיות קרום פלזמה מתאי גזע מזנכימליים של מח עצם לטיפול פוטנציאלי בתחליפי ציטופלסמה.J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים שיטה ליצירת בועיות קרום פלזמה מתאי גזע של מח עצם על ידי העברתן במהירות דרך מסנן ממברנה. PMV אלה מראים פוטנציאל לטיפול בתחליפי ציטופלסמה.

Protocol

1. הרכבת המנגנון

1. כדי להבטיח סטריליות, יש להדליק את האור האולטרה סגול (UV) של מכסה המנוע של תרבית רקמה למשך 30 דקות לפני השימוש.
2. פתחו את הברגת יחידת הסינון החד-פעמית בקוטר 25 מ"מ וטבלו את המכסה ותחתית היחידה בכוס זכוכית בנפח 200 מ"ל מלאה באתנול 75% למשך 30 דקות. היחידה עשויה פוליפרופילן ברמה רפואית.
3. הרימו את המכסה ותחתית היחידה באמצעות מלקחיים, נערו את שאריות האתנול ביד והניחו לחלקים להתייבש באוויר במשך 10 דקות במכסה המנוע.
4. יש להרטיב קרום פוליקרבונט בקוטר 19 מ"מ במי מלח חוצצי פוספט (PBS) ולהניח אותו בזהירות על גבי המטריצה התומכת של תחתית היחידה. לסרט הפולימרי משטח חלק ושטוח ונקבוביות 3 מיקרומטר חרוטות במסילה.
5. הרכיבו מחדש את היחידה על ידי הברגת המכסה בחוזקה לתחתית. ודא כי הממברנה אינה נעקרת מהמרכז.
6. הסר את המחט של מזרק אינסולין 1 מ"ל וצייר 1 מ"ל של PBS. חבר את המזרק ליחידת המסנן ולאחר מכן דחף PBS דרך היחידה כדי להרטיב את המכלול ולבדוק אם יש דליפה.

2. יצירת שלפוחיות קרום פלזמה (PMVs)

1. להקים תרבית תאי גזע מזנכימליים של מח עצם (BMSC), כפי שדווח על ידי Nemeth et al., במדיום תרבית מסוג Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco המכיל 15% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. לטפח את התאים בצלחת 6 בארות באינקובטור לח המכיל 5% CO₂ ב 37 ° C.
2. כדי להפיץ את התאים, להסיר את המדיום תרבית ולשטוף את הבאר עם 0.5 מ"ל של PBS ללא סידן.
3. הוסף 0.5 מ"ל של 0.25% חומצה טטראצטית טריפסין-אתילאנדיאמין (טריפסין-EDTA) ודגר על התאים ב 37 ° C במשך 3 דקות. הקש את הצלחת על כף היד כמה פעמים כדי להקל על ניתוק התא. עצור את העיכול על ידי הוספת 1 מ"ל של מדיום תרבית.
4. לאסוף את התאים בצינור חרוטי 15 מ"ל ולסובב ב 200 x גרם במשך 2 דקות בצנטריפוגה העליון ספסל. להשהות את התאים ב 4 מ"ל של מדיום תרבית aliquot את התאים לתוך שתי בארות של צלחת 6 בארות.
   הערה: תאים בדרך כלל מגיעים למפגש בסביבות 24 שעות.
5. כדי ליצור PMVs, לקצור את התאים מבאר אחת (בערך 5 x 10⁵ תאים) של צלחת 6 בארות על ידי עיכול טריפסין ו monodisperse את התאים ב 0.5 מ"ל של מדיום תרבית.
6. טענו את התאים לתוך מזרק האינסולין, חברו אותו ליחידת המסנן ודחפו את הבוכנה במהירות כדי לסחוט את התאים דרך המסנן. השליכו את המדיום המושחל מכיוון שאמורים להיות בתוכו רק כמה PMV.
7. טען 0.5 מ"ל נוסף של מדיום לתוך המזרק במהירות לדחוף אותו דרך המסנן. אסף את המדיום של האקסטרוזיה השנייה, המכילה PMV בגדלים שונים.
8. יש להעמיס 150 μL של התווך שנאסף לתוך צלחת בעלת תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ ולאפשר ל-PMV לשקוע בתחתית למשך כ-10 דקות. בחנו את ה-PMV תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה המצויד במצלמת CCD באמצעות עדשת 20X אובייקטיבית.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ממברנות IsoporeTM	מיליפור	TSTP04700	נקבוביות 3 מ"מ
יחידת סינון חד פעמית	Xinya, Shanghai, סין	25 מ " מ	פוליפרופילן ברמה רפואית
מזרק אינסולין	ב.ד.	328446	1 מ"ל