העברה פומית של תאי שמרים מותמרים למערכת החיסון של עכבר

תקציר

מקור: Hudson, L. E. et al., טרנספורמציה של שמרים פרוביוטיים והחלמתם מרקמות החיסון במערכת העיכול בעקבות גבאג' אוראלי בעכברים.J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מציג את הניהול האוראלי של תאי שמרים שעברו טרנספורמציה למודל עכבר. תאי השמרים שעברו טרנספורמציה ניתנים דרך הפה בטכניקת gavage, ומגיעים לקיבתו של העכבר. מאוחר יותר, התאים נודדים למעי הדק, שם תאי מיקרופולד בולעים אותם ומקלים על העברתם למדבקים של פייר ומקבלים גישה למערכת החיסון של המעי.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. מוטגנזה UV ליצירת זני שמרים אוקסוטרופיים

1. צור עקומות הישרדות כדי לקבוע את המינונים הדרושים של קרינה אולטרה סגולה (UV)
   1. הכינו מדיה מסוג YPD (תמצית שמרים, פפטון, דקסטרוז) וריאגנטים אחרים המפורטים בטבלה 1 בהתאם לנהלים סטנדרטיים, וחסנו מושבות בודדות ב-5-10 מ"ל של מדיה YPD. יש לדגור על תרביות על תוף רולר בטמפרטורה של 30°C O/N לרוויה למשך 8 שעות לפחות.
   2. קבע את ריכוז התאים של תרביות לילה (O/N) באמצעות ספקטרופוטומטר על ידי דילול תאים 1:10 במים בקובט פלסטיק. לדלל תאים לריכוז של 10⁷ תאים/מ"ל ב-20 מ"ל מים מזוקקים סטריליים.
   3. יוצקים תאים מדוללים לצלחת פטרי סטרילית מפלסטיק, ועם הסרת המכסה, מניחים את הצלחת 14 ס"מ מתחת לנורת UV.
   4. לחשוף תאים למנות סדרתיות של 5,000 μJ ו-10,000 μJ של קרינת UV, תוך חילוץ 500 μl של תאים לאחר כל הפרש קבוע, כך שהתאים נדגמים לאחר חשיפה ל-0 μJ, 5,000 μJ, 10,000 μJ, 15,000 μJ, 20,000 μJ, 25,000 μJ, 30,000 μJ, 40,000 μJ, ו-50,000 מיקרו-J של קרינת UV. מעבירים דגימות תאים שחולצו לצינורות סטריליים של 1.5 מ"ל ומדוללים סדרתית במרווחים של 1:10 במים סטריליים.
   5. תאי גלולה בכל דילול על ידי צנטריפוגה במיקרו-צנטריפוגה ב 16,000 x גרם למשך דקה אחת. שואפים סופרנאטנט ומרחפים מחדש בנפח 100 μl של מים סטריליים המתאימים לציפוי תאי שמרים. פיפטה את הנפח המלא של תאים מרחפים על לוחות המכילים מדיה מוצקה YPD ולהשתמש בפיזור סטרילי כדי לפזר תאים באופן שווה על פני כל לוחית.
   6. עטפו את קצוות הלוחות בפרפילם כדי למנוע התייבשות של מדיה וצלחות כיסוי ברדיד אלומיניום כדי למנוע הפעלה מחדש של האור ותיקון מוטציות המושרות על ידי UV. דגרו על צלחות הפוכות בטמפרטורה של 30°C במשך 2-4 ימים כדי לאפשר צמיחה של מושבות שמרים בנות קיימא (איור 1).
   7. ספור את מספר המושבות, אופציונלית בעזרת עט כדי לסמן מושבות שנספרו, עט נגדי אלקטרוני ידני, או מעמד דלפק עם הגדלה. התווה כאחוז מסך התאים המצופים בכל מנה של μJ של קרינת UV כדי ליצור עקומת הישרדות עבור שמרים מוקרנים (איור 2).
      הערה: זני שמרים הפלואידים צפויים לדרוש מינונים נמוכים יותר של קרינת UV ביחס לזנים דיפלואידים כדי להגיע לאותו אחוז הישרדות. זן שמרים חסר אנזימי תיקון DNA פונקציונליים, כגון מוטנט rad1 S. cerevisiae, יכול לשמש כבקרה חיובית כדי להצביע על נוכחות של קרינת UV במינונים נמוכים מאוד.
   8. לקבוע את המינון של מוטגנזה UV לשמש להקרנה על ידי התייחסות לעקומת ההישרדות שנקבעה ב 1.1.7. ערך x של הנקודה לאורך עקומת ההישרדות שבה y שווה ל-50 הוא מנת הקרנת UV שבה 50% מהשמרים שורדים. בדיקת מוטנטים באחוזי הישרדות נמוכים אלה עשויה להביא לתנובה גבוהה יותר של זנים שעברו מוטציה מוצלחת, במיוחד עבור שמרים דיפלואידיים. מנת ההישרדות של 50% עבור WT S. boulardii, כפי שמוצג באיור 2, היא בערך 18,000 μJ.
      הערה: למרות שמינונים גבוהים כאלה של UV מגבירים את הסיכון למוטציות בגנים עבור מסלולים תאיים שאינם גן הסמן האוקסוטרופי המעניין, חיסרון זה חייב להיות מאוזן כנגד הצורך לגרום למוטציות בשני העותקים של גן הסמן האוקסוטרופי. עבור זנים הפלואידים שבהם רק עותק גן אחד חייב להיות מוטציה, בדיקות סקר באחוזי הישרדות גבוהים יותר, כגון 90%, מפחיתות את הסיכון למוטציות נוספות ועדיין מאפשרות יצירה מספקת של מוטציות אוקסוטרופיות.
2. מוטגנזה UV וסינון עבור זני שמרים auxotrophic
   1. הכינו שמרים כמתואר בשלבים 1.1.1-1.1.3.
   2. חשוף שמרים למינון של קרינת UV המתאים להישרדות של 50%, כפי שנקבע ב 1.1.8. עבור WT S. boulardii, מינון זה נקבע כ-18,000 μJ (איור 2).
   3. לאסוף 1 מ"ל נפחים של שמרים UV מוקרן גלולה על ידי צנטריפוגה במיקרו-צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 1 דקה. לשאוף supernatant ו resuspend תאים ב 100 μl מים סטריליים.
      1. בחירת מוטנטים
         1. אם משתמשים בסלקציה כגון עם מוטציות ura3^- auxotrophic, צלחת שמרים מוקרנים על מדיה המכילה חומצה 5-fluoroorotic (5-FOA) כדי לבחור עבור תאים חסרי אנזים Ura3 פונקציונלי.
            הערה: כל שמרים המכילים עותקים פונקציונליים של Ura3 ימירו 5-FOA לרעלן 5-fluorouracil, מה שיוביל למוות תאי ויאפשר בחירה קלה של מושבות ura3 חסרות Ura3 פונקציונלי. גישות בחירה מקבילות אפשריות עבור LYS2 ו- LYS5; TRP1;וסמני MET2 ו-MET15 המשתמשים במדיה המכילה חומצה α-אמינואדיפית; 5-חומצה fluoroanthranilic; ומתיל כספית, בהתאמה.
         2. פיפטה את 100 μl של תאים מרחפים על מדיה מינימלית המכילה 5-FOA ולהשתמש בפיזור סטרילי כדי לצפות את הצלחת באופן שווה. עטפו את הצלחות בפרפילם ודגרו הפוך בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 2-4 ימים כדי לאפשר צמיחה של מושבות שמרים בנות קיימא.
         3. אשרו את הפנוטיפ ura3 של כל מושבה שמופיעה על לוחות 5-FOA על-ידי החזרה על לוחות YPD, אורציל ו-5-FOA (איור 3). השתמשו בקצה של קיסם סטרילי כדי לאסוף חלק ממושבה אחת וגררו בעדינות את התאים על פני לוחות YPD, ^אורציל ו-5-FOA טריים. שוב, לדגור צלחות עטופות הפוך ב 30 ° C במשך 2-4 ימים. < בר/> הערה: מושבות בנות קיימא יופיעו כגידולים מוגבהים ומעגליים פחות או יותר, בעוד שתאים שאינם בני קיימא יופיעו רק ככתם אטום ללא גידולים מורמים (איור 3).
      2. סינון מוטנטים
         1. אם אתם יוצרים מוטציה אוקסוטרופית שעבורה שיטות ברירה אינן זמינות, הכינו דילולים סדרתיים ביחס של 1:10 של תאי שמרים מוקרנים UV במים סטריליים ופיפטה את הדילולים על מצע YPD, תוך שימוש בפיזור סטרילי כדי לצפות את הצלחת באופן שווה.
         2. עוטפים את הצלחות בפרפילם ודגרים הפוך ב-30°C למשך 2-4 ימים. לקבוע איזה דילול איפשר צמיחה של מושבות בודדות שניתן להבחין ביניהן בקלות, בדרך כלל לא יותר מ -100 מושבות לכל צלחת.
         3. מוטגנזה UV חוזרת של דגימות שמרים כמתואר ב 1.2.1-1.2.3 ותאי צלחת בדילול נקבע זה. פיפטה את השמרים המדוללים על מדיה YPD, להשתמש מפזר סטרילי כדי להפיץ את התאים, לדגור צלחות עטופות הפוך ב 30 ° C במשך 2-4 ימים.
         4. מסך עבור auxotrophs על ידי ציפוי העתק על מדיה סלקטיבית חסר מטבוליט של עניין. ראשית, הדביקו כרית קטיפה סטרילית על מעמד צלחת והפכו את הצלחת עם מושבות מוקרנות UV על הקטיפה, תוך סימון כיוון הצלחת
         .
         5. לאחר מכן, הפכו צלחת טרייה חסרת מטבוליט מעניין על הקטיפה ולחצו קלות כלפי מטה כדי להעביר תאים מהקטיפה לצלחת. אחסנו את הצלחת המקורית בטמפרטורה של 4°C. עטפו ודגרו על הצלחת החדשה הפוכה בטמפרטורה של 30°C למשך 2-4 ימים.
         6. כחלופה לציפוי העתקים, מסך מוטנטים על ידי פסים מחדש מושבות מ-YPD למדיה סלקטיבית. השתמשו בקצה של קיסם סטרילי כדי לאסוף חלק ממושבה אחת וגררו בעדינות את התאים על פני צלחת YPD טרייה וצלחת חסרת מטבוליט מעניין. שוב לדגור על צלחות עטופות הפוכות ב 30 ° C במשך 2-4 ימים.
            הערה: יש להקפיד לבחור מושבות בודדות ולפסוח מושבות מספר פעמים כדי לאשר אוכלוסייה הומוגנית של תאים אוקסוטרופיים אמיתיים.
   4. כמו כן, לאשר את הפנוטיפ של תאים מוקרנים על ידי חיסון מושבות בודדות לתוך 5-10 מ"ל של YPD ומדיה ללא מטבוליט מתאים (למשל, באורציל ^מדיה עבור מוטציה ura3^). יש לדגור על תוף רולר בטמפרטורה של 30°C O/N כדי לאשר צמיחה של תאים במדיה של YPD, אך לא בהיעדר המטבוליט.
      הערה: אף על פי שדפוסי גידול על מדיה מוצקה צריכים להצביע בבירור על מצב אוקסוטרופי של שמרים, שמרים מסוימים יכולים לסבול לחצים וליצור מושבות קטנות הגדלות לאט על מדיה מוצקה, אך עדיין לא לסבול את אותם תנאים במדיה נוזלית (תצפיות שלא פורסמו). לפיכך יש לבצע חיסון לתרביות נוזליות כדי לאשר ביסודיות דפוסי גדילה של מוטנטים המוקרנים על ידי UV.
   5. לאחסון לטווח ארוך של מוטציות אוקסוטרופיות מאושרות, הכינו מלאי גליצרול על ידי חיסון תאים ל-10 מ"ל YPD ודגירת תוף רולר O/N ב-30°C. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה למשך 3 דקות ב-2,500 x גרם ומדיה שאיפה. יש להשהות מחדש תאים בגליצרול מסונן סטרילי 50%, להעביר לקריוביאל ולאחסן בטמפרטורה של -80°C.
      הערה: שמרים מוטגניים UV עשויים להכיל מוטציות במספר גנים שאינם בסמן האוקסוטרופי המעניין. לפני שנמשיך בשימוש במוטציות אוקסוטרופיות מאומתות, יש להמשיך לנתח זנים אלה באמצעות ריצוף גנים והערכת עמידות ל- pH, עקה של חומצות מרה ומאפיינים אחרים הרלוונטיים לזנים פרוביוטיים, כמתואר במקום אחר². בנוסף, יש לשקול שימוש בהומולוגיה של PCR או מיקוד CRISPR/Cas9 כדי לבצע מוטציות סלקטיביות יותר בסמנים אוקסוטרופיים כחלופה למוטגנזה של UV.

2. טרנספורמציית שמרים

1. LiOAc טרנספורמציה של שמרים
   1. יש לחסן מושבות שמרים בודדות ב-5-10 מ"ל של מצעי YPD ולדגור על תוף רולר בטמפרטורה של 30°C O/N.
   2. כדי לגרום לצמיחת שלב היומן ולהגביר את יעילות ספיגת הפלסמיד, קבעו את ריכוז התאים באמצעות ספקטרופוטומטר כדי למדוד דילול של 1:10 תאים במים סטריליים בקובט פלסטיק. לדלל תרביות O/N לצפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD₆₀₀) של 0.16-0.2 (בערך 2 x 10⁶- 2.5 x 10⁶ תאים/מ"ל) ב 50 מ"ל של YPD חם טרי ולדגור תאים על שייקר פלטפורמה מסלולית להגדיר 200 סל"ד עד התרבית מגיע בערך 1 x 10⁷ תאים / מ"ל, בדרך כלל בסביבות 4 שעות.
      הערה: ניתן למדוד את יעילות הטרנספורמציה כפונקציה של מספר יחידות יצירת מושבות שמרים (CFU) שעברו טרנספורמציה מוצלחת לכל מק"ג של דנ"א פלסמיד. יעילות מוגברת גורמת ליותר מושבות מותמרות לכל מק"ג של DNA פלסמיד. תת-גידול תאי שמרים ואיסוף במהלך שלב הגדילה הוא אחד הגורמים המגבירים את יעילות הטרנספורמציה.
   3. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 2,500 x גרם במשך 3 דקות.
   4. שואפים את הסופרנאטנט ומעבירים תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל על ידי השעיית הגלולה במים סטריליים של 1 מ"ל.
   5. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 16,000 x גרם למשך דקה אחת במיקרוצנטריפוגה, שואפים את הסופרנאטנט ושוטפים תאים על ידי השעיה במאגר TE/LiOAc (Tris EDTA/ליתיום אצטט) של 1 מ"ל.
   6. חזור על תאי צנטריפוגה והשהיה מחדש במאגר TE/LiOAc לריכוז של 2 x 10⁹ תאים/מ"ל.
   7. הכינו תערובות טרנספורמציה עם כל אחד מהבאים: 50 μl של שמרים מוכנים במאגר TE/LiOAc, 5 μl של DNA נשא (10 מיקרוגרם / μl), ו 1 μl של DNA פלסמיד (1 מיקרוגרם). מיקרוגרמים של דנ"א פלסמיד עשויים להיות טיטרציה כמו כמויות הולכות וגדלות של DNA עשוי או לא יכול להוביל ליעילות טרנספורמציה מוגברת.
      הערה: עבור זן שמרים מוטנטי חסר סמן אוקסוטרופי אחד, רק פלסמיד אחד המקודד את הסמן יכול להשתנות בכל דגימה. יתר על כן, שימוש בפלסמיד המקודד חלבון קל לזיהוי, כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), יאפשר קביעה יעילה של קיפול תקין וביטוי של חלבון הטרולוגי על ידי זן השמרים לאחר טרנספורמציה.
   8. לכל תכשיר יש להוסיף 300 μl של PEG/LiOAc/TE ולערבב היטב. דגירה של תאים שלמים עם פוליאתילן גליקול (PEG) חיונית לשינוי יעיל.
   9. יש לדגור על ההכנות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם תסיסה על ידי הנחת צינורות מיקרוצנטריפוגות בכד המונח על שייקר פלטפורמה מסלולית ב-200 סל"ד.
   10. הוסף 35 μl של dimethyl sulfoxide (DMSO) לכל תגובה ותאי הלם חום במשך 15 דקות באמבט מים 42 ° C. למרות שישנם דיווחים סותרים על היתרון הנוסף של DMSO, הלם חום של תאי שמרים שלמים הוכח כמגביר באופן משמעותי את יעילות הטרנספורמציה.
   11. יש לשטוף את התאים באמצעות צנטריפוגה כמו ב-2.1.5, לשאוף או להוריד את הסופרנטנט, ולהתלות מחדש ב-1 מ"ל מים סטריליים. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כדי לפרק את גלולת התא.
       הערה: זה קריטי להסיר ביסודיות את supernatant כי המדיה המשמשת ליצירת תאים מוכשרים יכול לעכב צמיחת שמרים והיווצרות מושבה.
   12. חזור על כדורי התא כמו ב- 2.1.5, שאף את הסופרנטנט, והשהה מחדש את התאים במים סטריליים של 100 מיקרוליטר. הפיפסט את מלוא הנפח על צלחת סלקטיבית והשתמש בפיזור סטרילי כדי לצפות את הצלחת באופן שווה בשמרים שעברו טרנספורמציה.
   13. עטפו קצוות של צלחות מצופות בפרפילם כדי למנוע התייבשות של מדיה ודגרו הפוך בטמפרטורה של 30°C למשך יומיים כדי לאפשר צמיחה של תאי שמרים מותמרים. טרנספורמציה מוצלחת ויעילה ובחירה אוקסוטרופית של Saccharomyces cerevisiae מניבה מספר גבוה של מושבות לכל הכנת טרנספורמציה, אף על פי שהיבול יכול להיות נמוך בהרבה עבור זנים אחרים (איור 4).
   14. אחסנו את צלחות השמרים לטווח קצר (בדרך כלל 1-3 שבועות) הפוכות ומכוסות ב-4°C. הכינו מלאי גליצרול של שמרים מותמרים כמתואר ב-1.2.5 לאחסון לטווח ארוך.
       הערה: מחקרים נוספים הבודקים CFU שעבר טרנספורמציה נחוצים כדי לקבוע את יציבות הפלסמיד ולהעריך ביטוי תקין של חלבון הטרולוגי. תיאורים יסודיים של יציבות פלסמיד, שימוש באימונובלוטינג לאיתור חלבונים מפורק שנמצאו מדגימות תאים, בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA) לזיהוי חלבונים תלת ממדיים מקופלים כראוי, והשימוש ב-GFP במחקרי שמרים זמינים במקומות אחרים. איור 5 מראה תמונה מייצגת של ביטוי GFP מוצלח ב-S. cerevisiae שעבר טרנספורמציהיחסית לתאים שלא עברו טרנספורמציה. שימוש בחלבון פלואורסצנטי כזה הוא אחד האמצעים לקביעה יעילה של ייצור חלבון הטרולוגי מוצלח.
2. אלקטרופורציה של שמרים
   1. יש לחסן מושבות שמרים בודדות ב-5-10 מ"ל של מצעי YPD ולדגור על תוף רולר בטמפרטורה של 30°C O/N.
   2. קבע את ריכוז התאים באמצעות ספקטרופוטומטר כדי למדוד דילול של 1:10 של תאים במים סטריליים. יש לדלל תרביות O/N במדיית YPD טרייה חמה וטרייה של 100 מ"ל לכמות שוות ערך ל-OD₆₀₀ של כ-0.3. לדגור על תת-תרביות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס בשייקר פלטפורמה מסלולית המוגדר ל-200 סל"ד עד להגעה ל-OD₆₀₀ של כ-1.6, בדרך כלל 4-5 שעות. כל תת-תרבית של 100 מ"ל תייצר מספיק תאים מותנים לשתי תגובות טרנספורמציה.
   3. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 2,500 x גרם במשך 3 דקות. לשאוף את supernatant ולשטוף תאים על ידי resuspending ב 50 מ"ל מים סטריליים קרים כקרח. חזור על השטיפה על ידי תאי כדור, שאיפת סופרנטנט והשעיה מחדש במים סטריליים קרים כקרח טריים של 50 מ"ל
   .
   4. משחררים שוב את התאים ומרחפים מחדש בחיץ אלקטרופורציה קר כקרח של 50 מ"ל (1 M סורביטול, 1 mM סידן כלורי (CaCl₂)).
   5. חזור על ספין כמו ב- 2.2.3, שאף סופרנטנט והשהה מחדש תאים ב- 20 מ"ל 0.1 M LiOAc/10 mM dithiothreitol (DTT). יש לדגור על תוף גלילה בטמפרטורה של 30°C למשך 30 דקות. דגירה מוקדמת של תאים ב- LiOAc ו- DTT מגבירה באופן סינרגטי את יעילות האלקטרופורציה.
   6. גלולה את התאים כמו ב 2.2.3, להסיר supernatant, ולשטוף על ידי resuspending ב 50 מ"ל חיץ אלקטרופורציה קר קרח. חזור על הצנטריפוגה והשהה תאים בחיץ אלקטרופורציה קר כקרח לנפח סופי של 1 מ"ל.
   7. מכינים על קרח: תאי שמרים מותנים, קוביות אלקטרופורציה סטריליות ודנ"א פלסמיד. מיד לאחר ההשעיה הסופית של תאים מותנים בחיץ אלקטרופורציה של 1 מ"ל, יש לשלב תאי שמרים מותנים של 400 מיקרוליטר עם כ-1 מיקרוגרם של DNA פלסמיד ולהוסיף לקובט אלקטרופורציה קר כקרח של 0.2 מיקרומטר. שימוש בכמויות מוגברות של דנ"א עשוי להגביר מעט את יעילות הטרנספורמציה. יש לדגור על תגובה על קרח למשך 5 דקות, ולאחר מכן לבצע אלקטרופורטינג עם אלקטרופורטור המוגדר ל-2.5 קילו-וולט ו-25 מיקרו-פרנהייט.
      הערה: כפי שמתואר ב-2.1.7, זן שמרים מוטנטי חסר סמן אוקסוטרופי אחד יכול להשתנות עם פלסמיד אחד בלבד המקודד את הסמן המוטנטי לכל דגימה. כמו כן, שימוש בפלסמיד המקודד חלבון קל לזיהוי כגון GFP מאפשר קביעה יעילה של קיפול תקין וביטוי של חלבון הטרולוגי לאחר טרנספורמציה.
   8. מעבירים תאים מחושמלים ל-8 מ"ל של תערובת 1:1 של סורביטול YPD:1M ומאפשרים לתאים לדגור על תוף רולר בטמפרטורה של 30°C למשך 60 דקות.
   9. תאי גלולה כמו ב 2.2.3 ו resuspend ב 100 μl 1: 1 YPD:1 M סורביטול. מצופים את מלוא הנפח על מדיה סלקטיבית המכילה סורביטול בנפח 1 M, עוטפים קצוות של צלחות בפרפילם, ודגרים על צלחות הפוכות בטמפרטורה של 30°C למשך 2-5 ימים כדי לאפשר צמיחה של תאי שמרים מותמרים.
      הערה: חיוני לבדוק שמרים מותמרים כדי להעריך ביטוי תקין של חלבון הטרולוגי, כמתואר ב-2.1.14 וב-2.2.7.
3. גבאג' אוראלי של עכברים עם שמרים שעברו טרנספורמציה
   1. לבצע את כל הליכי הטיפול והטיפול בבעלי חיים בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ולאישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
   2. הכינו תרביות שמרים O/N על ידי חיסון מושבות בודדות של שמרים אוקסוטרופיים שעברו טרנספורמציה ל-5-10 מ"ל של מדיה סלקטיבית. יש לדגור על תרביות O/N במשך 8 שעות לפחות על תוף רולר בטמפרטורה של 30°C עד לרוויה.
      הערה: שימוש בחלבוני בדיקה המקודדים פלסמיד כגון GFP יאפשר בדיקת ביטוי חלבון קלה בשמרים gavated, כמתואר ב 4.7.
   3. להשראת ביטוי מקסימלי של חלבונים ולזירוז צמיחה בשלב הלוג, הכינו תת-תרבויות מתרביות O/N על ידי דילול לשווה ערך OD₆₀₀ של כ-0.16-0.2 ב-50 מ"ל של מדיה מתאימה כמתואר ב-2.1.2.
   4. קבע את הריכוז של תאים תת-מתורבתים כמו ב- 1.1.2 והתאם ל- 10⁹ תאים / מ"ל. הכן מנה של 100 μl לכל עכבר, עם נפח נוסף של כמה מאות μl לכל קבוצה כדי לשפר את הדיוק וקלות טעינת הדגימה.
   5. תאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 2,500 x גרם במשך 3 דקות או במיקרו-צנטריפוגה ב 16,000 x גרם במשך 1 דקה. שאפו תאי סופרנאטנט והשהיה מחדש על ידי הוספת נפח שווה של מים סטריליים וזילוף עדין למעלה ולמטה.
   6. קבע מחט מד מתאימה (22 גרם עבור 15-20 גרם עכברים) על מזרק סטרילי 1 מ"ל וטען דגימת שמרים, הקפד לחסל כל בועות ולהגדיר את הבוכנה לתוספת של 100 μl. יש להעמיס מזרק נוסף במים סטריליים לעכברי הבקרה ולבדוק נוכחות של שמרים מזהמים.
   7. הרימו את העכבר כדי להיתפס באמצעות היד הלא דומיננטית, כשהאצבע המורה והאגודל אוחזים בחוזקה בעור סביב הצוואר (איור 5A). תוחבים את הזנב מתחת לאצבע הקטנה כדי למנוע תזוזה של פלג הגוף התחתון. ודא כי האחיזה מאובטחת ואוסרת על העכבר להזיז את ראשו על מנת למנוע נזק לרקמות פנימיות במהלך gavage.
      הערה: העריכו עד כמה יש להחדיר את מחט ה-gavage על ידי הצמדת המחט לעכבר כך שהנורה תהיה אחידה עם התהליך הקסיפואיד של עצם החזה. החדרת אורך זה של המחט תאפשר בדרך כלל לנורת מחט הגבאג' להיכנס לקיבה.
   8. באמצעות היד הדומיננטית, להחדיר בעדינות את מחט gavage לתוך הוושט העכבר על ידי זווית המחט לאורך הגג של הפה ואת החלק האחורי של הגרון, שמירה מעט משמאל למרכז. המתינו עד שהעכבר יבלע את פקעת המחט ואפשרו למחט לרדת מעט רחוק יותר לנקודה המוערכת ב-3.7 (איור 5B). אם כל התנגדות מורגשת במהלך החדרת מחט gavage או אם העכבר בכל עת מתחיל להתנשם, בעדינות להסיר את המחט ושוב לנסות למצוא את הוושט.
   9. לאחר שהעכבר בלע את הנורה של מחט gavage, לחץ בעדינות על בוכנה מזרק כדי לתת 100 μl (10⁸ CFU) של שמרים ישירות לתוך קיבת העכבר.
      הערה: למרות שעכברים אינם מסוגלים להקיא אף אחת מהתמיסה לאחר מתן התרופה, ייתכן שריפלוקס יתרחש במהלך ההשגה. החדרה נכונה של מחט gavage, כמו גם התאמת נפח וצמיגות של הפתרון, יכול לעזור להגביל reflux ולהבטיח מינון מדויק.
   10. בזהירות להסיר את מחט gavage מן הבטן העכבר ואת הוושט ולהחזיר את העכבר לכלוב. בדוק כי העכבר נושם ונע כרגיל לאחר gavage כדי לוודא כי מחט gavage הוכנס כראוי לאורך כל ההליך וכי לא נשאף פתרון.

טבלה 1. רשימת ריאגנטים. מתוארים הריאגנטים הדרושים להכנת כל אחד מהפתרונות, מצעי שמרים וצלחות, ומאגרי טרנספורמציה המשמשים לפרוטוקולים בכתב יד זה.

פתרונות	מדיה וצלחות שמרים	ריאגנטים טרנספורמציה
פוליאתילן גליקול (PEG) 50%:	YPD:	TE/LiOAc:
250 גרם PEG 3350	20 גר' פפטון	50 מ"ל 10x TE
500 מ"ל מים סטריליים	20 גר' דקסטרוז	50 מ"ל 10x (1M) LiOAc
סינון מעוקר	10 גר' תמצית שמרים	400 מ"ל מים סטריליים
	1 ליטר מים	סינון מעוקר
	אוטוקלאבה
TE 10x:	לוחות YPD:	PEG/TE/LiOAc:
100 מ"מ טריס	20 גר' פפטון	400 מ"ל 50% PEG
10 מ"מ EDTA	20 גר' דקסטרוז	50 מ"ל 10x TE
pH עד 7.5 ולסנן לעקר	20 גר' אגר	50 מ"ל 10x (1M) LiOAc
	10 גר' תמצית שמרים
	1 ליטר מים
	אוטוקלאבה
20% גלוקוז:	Uracil- מדיה סלקטיבית	DNA נשא (SS DNA):
200 גר' דקסטרוז	2 גרם תערובת חומצות אמינו חסרה אורציל	יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C ולפני השימוש בחום של 1-2 דקות ב-100°C כדי להמיס גדילים ולאחסן על קרח
1 ליטר מים	6.7 גרם שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו
סינון מעוקר	1 ליטר מים
	עיקור על ידי autoclaving או סינון סטרילי
	יש להוסיף 20% גלוקוז ביחס 1:10 לפני השימוש
50% גליצרול:	אורציל- צלחות:	חיץ אלקטרופורציה:
500 מ"ל גליצרול	בצלוחית של 250 מ"ל:	1 מטר סורביטול
500 מ"ל מים	2 גרם תערובת חומצות אמינו חסרה אורציל	1 מ"מ CaCl2
אוטוקלאבה	6.7 גרם שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו	ממלאים במים מזוקקים
	150 מ"ל מים	Autoclave ולאחסן ב 4 °C
	בצלוחית בנפח 2 ליטר:
	20 גר' אגר
	750 מ"ל מים
	צלוחיות Autoclave בנפרד, ולאחר מכן לערבב יחד עם 100 מ"ל 20% גלוקוז
IMDM מלא	צלחות 5-FOA+:	LiOAc/DTT
500 מ"ל Dulbecco של Iscove's Modified Dulbecco Media	אוטוקלאבה בצלוחית 2 ליטר:	0.1 מטר LiOAc
5 מ"ל פניצילין סטרפטומיצין גלוטמין 100x	20 גר' אגר	DTT של 10 מ"מ
500 μl 2-מרקפטואתנול	750 מ"ל מים
10% סרום בקר עוברי מומת בחום	לערבב:
2.5 מ"ל נתרן פירובט 100 מ"ל	6.7 גרם שמרים בסיס חנקן ללא חומצות אמינו
	2 גר' תערובת חומצות אמינו ללא אורציל
	150 מ"ל מים חמימים
	כאשר קריר, להוסיף:
	0.05 גרם אבקת אורציל
	1 גרם 5-FOA
	ערבוב וסינון סטריליזציה
	הוסף לתמיסת אגר אוטוקלאבד
	יש לערבב עם 100 מ"ל 20% גלוקוז

תוצאות

איור 1. מושבות שמרים גדלו על מדיה YPD. צלחת YPD לדוגמה המציגה יחידות יוצרות מושבה קיימא (CFU) של שמרים פרוביוטיים לאחר הקרנת UV. התאים דוללו באופן סדרתי כך שניתן להבחין ולספור CFU בודד.

איור 2. עקומת הישרדות עבור שמרים פרוביוטיים דיפלואידיים. מספר S

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ספקטרופוטומטר SmartSpec 3000	BioRad	170-2501	דוגמה לספקטרופוטומטר לקביעת ריכוז תאים ו-OD600 של תרביות שמרים
ניו ברנזוויק רולר תוף	אפנדורף	M1053-4004	דוגמה לתוף רולר לדגירה של תרבית שמרים
UV Stratalinker 2400	סטרטג'ן	400075-03	סטרטלינקר לדוגמה
SC6PLUS דלפק מושבת סטיוארט	11983044	פישר סיינטיפיק	מעמד לוחית עם רישומי הגדלה שמושבה נספרת על חישה של לחץ מהעט
מונה מושבת כלי מדע	F378620002	בל-ארט Scienceware	עט דלפק מושבה ידני
התקן ציפוי העתק	פישרברנד	09-718-1	דוגמה של מעמד ורפידות לציפוי העתק
ריבועי קטיפה	פישרברנד	09-718-2
מפזרי תאים סטריליים בצורת L	פישרברנד	14665230
חומצה דאוקסיריבונוקלאית, גדיל יחיד מאשכי סלמון	סיגמא-אולדריץ'	D7656-1ML	DNA נשא לדוגמה עבור טרנספורמציית LiOAc של שמרים
מחטי גאבאג'	בריינטרי סיינטיפיק	N-PK 002	עבור עכברים 15-20 גרם, המחט המוצעת היא 22 מד (כדור 1.25 מ"מ), 1 במחט ארוכה וישרה. עבור עכברים במשקל של יותר מ-20 גרם, ניתן להשתמש ב-20 מד או גדול יותר מחטי gavage ישרות או מעוקלות
1 מ"ל מזרק שחפת חד פעמי סטרילי	בקטון דיקינסון	BD 309659
מלקחיים קהים כגון Electron Microscopy Sciences 7" (178 מ"מ) קצה משונן, מלקחיים רחבים אחיזה	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	77937-28	דוגמה למלקחיים קהים הדרושים לדיסקציה
מספריים לדיסקציה ישרה ומעוקלת	מדעי מיקרוסקופ אלקטרונים	72966-02 ו-72966-03	דוגמאות למספריים הדרושים לדיסקציה