יצירת נויטרופילים הקשורים לגידולים אנטי-אנגיוגניים

תקציר

מקור: Pylaeva, E., et al. העברת נויטרופילים הקשורים לגידול שעבר מניפולציה לעכברים נושאי גידול כדי לחקור את הפוטנציאל האנגיוגני שלהם ב- Vivo. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים בדיקה ליצירת נויטרופילים הקשורים לגידול אנטי-אנגיוגני (TANs). עם נטילת גידול מלנומה מורין המכיל TANs פרו-אנגיוגניים, התאים הבודדים מבודדים באמצעות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ומטופלים במעכב של ניקוטין-אמיד פוספוריבוזיל טרנספראז (NAMPT) כדי להפחית את היכולת לעורר אנגיוגנזה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

הערה: התוכנית הכוללת של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

1. הכנת קו תאי מלנומה B16F10

1. הכינו תאים שליליים למיקופלסמה שגדלו לשכבה חד-שכבתית של 90% (בערך 10 x 10⁶ תאים / צלוחיות T75) בתווך דולבקו מעובד שלם של איסקוב (IMDMc: IMDM + 10% סרום בקר עוברי (FBS) + 1% פניצילין-סטרפטומיצין).
2. הסר את המדיום ושטוף את התאים במי מלח חוצצים פוספט (PBS). יש למרוח 6 מ"ל של תמיסת ניתוק תאים המכילה אנזימים מפרקי חלבון וקולגנוליטים (ראו טבלת חומרים), ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 2 דקות.
3. דפקו את הבקבוק בעדינות כדי לגייס את התאים הדבקים שנותרו מלמטה. אסוף את מתלה התא בצינורות 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 7 דקות ו 20 ° C.
4. הסר את supernatant, ו resuspend את הגלולה היטב ב 1 מ"ל של PBS. הוסף 14 מ"ל PBS וצנטריפוגה (300 x גרם ו 20 ° C במשך 7 דקות).
5. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה ב 1 מ"ל של PBS.
6. ספרו את התאים והשהו אותם מחדש לריכוז של 3 x 10⁶/mL PBS (לשלב 2) או 6 x 10⁶/mL PBS (לשלב 6) להזרקה. שמור תאים על קרח למשך 30 דקות לכל היותר.

2. מודל גידול אלוגני בעכברים

1. יש להשתמש ב-10 נקבות עכברי Ifnar1-/- בני 8-12 שבועות המוחזקות בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF).
   הערה: נקבות עכברים עדיפות במודל תת עורי של צמיחת גידול, שכן הזכרים אגרסיביים יותר ולכן נוטים להפרות של אתר הגידול, המשפיעות על צמיחת הגידול.
2. לגלח את העור של העכבר על האגף עם מכונת גילוח חשמלית, ולחטא את העור עם רקמות רטובות עם 70% אתנול.
3. יש לאסוף את תאי המלנומה B16F10 המוכנים בריכוז של 3 x 10⁶/mL PBS (ראה שלב 1) במזרק 1 מ"ל ומחט 0.4 x 19 מ"מ. להזריק 100 μL של המתלה תת עורית.
   1. מערבבים את התאים היטב לפני כל הזרקה. השתמש במחטים בקוטר של לא פחות מ -0.4 מ"מ כדי לא להפריע לתאי הגידול.
4. הניחו עד 5 עכברים בכלוב אחד, ושלטו בגודל הגידול (אורך, רוחב ועומק) בעזרת קליפר למשך 14 יום.
   הערה: על פי תקנות בעלי החיים, גודל הגידול לא יעלה על 15 מ"מ קוטר, עכברים עם גידולים גדולים יותר או נמק / פתוח יש להקריב מראש.
5. ביום ה-14, הקריבו את העכברים בתא CO₂.
6. לחטא את העור עם אתנול 70% ולהסיר גידולים עם מספריים ומלקחיים בצלחת פטרי סטרילית. שמור גידולים בצינור של 50 מ"ל בתווך הנשר המעובד של Dulbecco (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% פניצילין-סטרפטומיצין) על קרח.

3. בידוד TAN

1. מניחים גידולים בצלחות סטריליות של 6 בארות, 5 גידולים לכל באר. חותכים גידולים לחתיכות 2-3 מ"מ עם מספריים סטריליים.
   1. יש לעכל עם 1 מ"ל של תמיסת D/DNase I של דיספאז/קולגנאז I (0.2 מ"ג/0.2 מ"ג/100 מ"ג ב-1 מ"ל DMEMc) לכל גידול. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C, 5% CO₂ באינקובטור לח, ולערבב עם מזרק 10 מ"ל ללא מחט כל 15 דקות 3 פעמים.
2. כדי להסיר סיבים לא מעוכלים, רשת תאים דרך מסננים של 100 מיקרומטר לתוך צינורות של 15 מ"ל (באר אחת לכל מסנן לכל צינור). הוסף PBS ל 15 מ"ל, צינורות צנטריפוגות ב 460 x גרם, 4 ° C במשך 5 דקות, והסר את supernatant.
3. אריתרוציטים Lyse עם חיץ lysis (NH₄Cl 150 mM, KHCO₃ 10 mM, EDTA 0.1 mM, pH 7.3, 20 °C) על ידי הוספת 1 מ"ל לתוך כל צינור. מערבבים היטב, ומשלבים את התמיסה מכל הצינורות לאחת. עצור את התגובה לאחר 2 דקות עם 11 מ"ל של DMEMc קר כקרח (4 ° C).
4. צנטריפוגה ב 460 x גרם, 4 ° C במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant. להשעות את הגלולה עם 15 מ"ל של PBS קר. צנטריפוגה ב 460 x גרם, 4 ° C במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant.
5. להשעות את הגלולה ב 1 מ"ל של PBS. הוסף 3 μL של נוגדנים Fc-block (CD16 / CD32, מלאי 0.5 מ"ג / מ"ל), ודגור על קרח במשך 15 דקות.
6. הוסף נוגדנים: 10 μL של Ly6G-phycoerythrin (Ly6G-PE, מלאי 0.2 מ"ג / מ"ל) ו 10 μL של CD11b-allophycocyanin (CD11b-APC, מלאי 0.2 מ"ג / מ"ל). מוסיפים 20 μL של צבע כדאיות 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI, ציר 5 מ"ג/מ"ל) ודגורים על קרח בחושך למשך 30 דקות.
   הערה: ניתן להשתמש בשילוב נוסף של צבעי כדאיות וצימודים פלואורסצנטיים של נוגדנים.
7. מוסיפים PBS עד 15 מ"ל, צנטריפוגה ב 460 x גרם, 4 ° C למשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant.
8. השהה מחדש את הגלולה ב- DMEMc לריכוז של כ- 10 x 10⁶/mL, ושמור על קרח.
9. מיין נויטרופילים CD11b⁺ Ly6G^hi alive (DAPI-negative) באמצעות ממיין תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (אסטרטגיית gating, ראה איור 2).
   הערה: שמור את הצינור עם תרחיף תאים ואת הצינור עם DMEMc עבור תאים ממוינים ב 4 ° C. השתמש בהגדרות המיון האופטימליות הבאות: פייה של 70 מיקרומטר, קצב סף של מקסימום 22,000 אירועים לשנייה וקצב זרימה של 1-3.
10. בדוק את טוהר הנויטרופילים הממוינים באמצעות ציטומטר לקבלת טוהר מומלץ של >95%.
11. צנטריפוגה ממיינת נויטרופילים ב 460 x גרם, 4 ° C במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant. השהה מחדש את התאים הממוינים ב- DMEMc לריכוז של 1 x 10⁶/mL.
    הערה: המספר הצפוי של נויטרופילים בגידול B16F10 אחד בן 14 יום (קוטר 10 מ"מ) הוא בערך 3 x 10⁴ תאים.

4. עיכוב NAMPT ב- TANs in vitro

1. הכינו מלאי FK866 (מעכב NAMPT) בדימתיל-סולפוקסיד (DMSO) בריכוז סופי של 100 מילימול.
2. זרעים ממוינים נויטרופילים (שלב 3.11) ל-2 בארות של צלחת U-תחתונה של 96 בארות (1.5 x 10,⁵ נויטרופילים / באר). הוסף את FK866 לבאר ההתערבות (ריכוז סופי של 100 ננומטר), וכמות שווה של DMEMc עם DMSO לבאר הבקרה. לדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C, 5% CO₂ באינקובטור לח.
3. צנטריפוגה ב 460 x גרם, 4 ° C במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant. להשהות מחדש ב 200 μL של PBS בכל באר. חזור על הפעולה פעמיים.
4. צנטריפוגה ב 460 x גרם, 4 ° C במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant. השהיה מחדש במדיום גדילה מסחרי של תאי אנדותל (בתוספת תוספת של 4 μL/mL לגידול תאי אנדותל, גורם גדילה רקומביננטי של אפידרמיס אנושי 0.1 ng/mL, גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי אנושי רקומביננטי 1 ננוגרם/מ"ל, הפרין 90 מיקרוגרם/מ"ל ו-1 מיקרוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון) לריכוז סופי של 0.2 x 106 תאים/מ"ל (ב-0.75 מ"ל) (לשלב 5) או ב-PBS לריכוז הסופי של 0.6 x 10⁶ תאים/מ"ל ( ב 0.25 מ"ל).

תוצאות

איור 1. התוכנית של הפרוטוקול. שלב 1. הכנת קו תאי מלנומה B16F10; 2. מודל גידול אלוגני בעכברים; 3. בידוד של TANs מן הגידולים; 4. עיכוב NAMPT ב- TANs במבחנה; 5. הערכת תכונות אנגיוגניות של TANs בבדיקת טבעת אבי העורקים; 6. העברה מאמצת של נויטרופילים מטופלים במודל הגידול האלוגני; 7. ניטור צמיחת גידול, בדיקה היסטולוגית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 מ"ל צינורות	Sarstedt AG & Co., נומברכט, גרמניה	6,25,54,502
50 מ"ל צינורות	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, גרמניה	227261
5 מ"ל / 10 מ"ל / 25 מ"ל טיפים סטריליים לפיפטה אוטומטית	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, גרמניה	6006180 / 607180 / 760180
6 צלחות תרבית תאים שטוחות היטב	Sarstedt AG & Co., נומברכט, גרמניה	8,33,920
96 צלחות תרבית תאים שטוחות היטב	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, גרמניה	655180
96 צלחות תרבית תאים תחתונות U	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, גרמניה	65018
CD11b נגד עכבר	BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, ארה"ב	553312	שיבוט M1/70, APC-מצומד, 0.2mg/mL
Ly6G נגד עכבר	BioLegend, קליפורניה, ארה"ב	127608	שיבוט 1A8, מצומד PE, 0.2 מ"ג/מ"ל
BD FACS AriaII	BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, ארה"ב		סדרן תאים
קאליפר	Vogel Germany, Kevelaer, גרמניה
מונה תאי Casy	Innovatis, Roche Innovatis AG, בילפלד, גרמניה
מסננים סטריליים Cell Trics 50μm / 100 μm	Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, גרמניה	04-004-2327 / 04-004-2328
צנטריפוגה רוטינה 420 R	Andreas Hettich, טוטלינגן, גרמניה	4706
קולגנאז D	Sigma-Aldrich/Merck, דרמשטאדט, גרמניה	11088858001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	BioLegend, קליפורניה, ארה"ב	422801	מלאי: 5 מ"ג/מ"ל
דיספסי I	Sigma-Aldrich/Merck, דרמשטאדט, גרמניה	D4818-2MG
DMEM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, מסצ'וסטס, ארה"ב	41966-029	DMEM מלא: DMEM + 10% FBS + 1% פניצילין-סטרפטומיצין
DMSO (דימתילסופוקסיד)	WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, גרמניה	WAK-DMSO-10	CryoSure-DMSO
DNase I	Sigma-Aldrich/Merck, דרמשטאדט, גרמניה	DN25-100MG
DPBS	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, מסצ'וסטס, ארה"ב	14190-094
מדיום צמיחת תאי אנדותל	PromoCell, Heidelberg, גרמניה	C-22010
FBS (סרום בקר עוברי)	Biochrom, ברלין, גרמניה	S0115
בלוק Fc (CD16/32 נגד עכבר)	BD Pharmingen, Becton Dickinson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, ארה"ב	553142	שיבוט 2.4G2, מלאי: 0.5mg/mL
FK 866 הידרוכלוריד	Axon Medchem, חרונינגן, הולנד	אקסון 1546	מלאי: 100 mM
עז נגד ארנב IgG H&L	Abcam, Cambridge, בריטניה	dorit_1975	Cy3-מצומד, מלאי: 0.5 מ"ג/מ"ל
Heracell 240i CO2 אינקובטור	Thermo Fisher Scientific, Waltham, ארה"ב	51026334
IMDM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, מסצ'וסטס, ארה"ב	12440-053	IMDM הושלם: IMDM + 10% FBS + 1% פניצילין-סטרפטומיצין
מכונת גילוח Isis GT420	B. Braun Asculap, Suhl, גרמניה	90200714
ממברנת מרתף מטריג'ל מטריקס	Corning Life Sciences, אמסטרדם, הולנד	7205011
שריר חד שבטי נגד אקטין α חלק	Sigma-Aldrich/Merck, דרמשטאדט, גרמניה	F3777	FITC-מצומד, אין מידע על ריכוז המניות
מחטים 0.4 מ"מ x 16 מ"מ	BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, ארה"ב	302200
נאומאונט	Merck, Darmstadt, גרמניה	HX67590916
סרום עיזים רגיל	מעבדות Jackson ImmunoResearch, ווסט גרוב, ארה"ב	005-000-121
פניצילין סטרפטומיצין	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, מסצ'וסטס, ארה"ב	15140-122
פיפטה אוטומטית פיפטוס	Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, גרמניה	9907200
הרכבה ProLong Gold Antifade עם DAPI	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, מסצ'וסטס, ארה"ב	P36935
ארנב נגד עכבר למינין גמא 1 שרשרת	Immundiagnostik, Bensheim, גרמניה	AP1001.1	אין מידע על ריכוז המלאי
StemPro Accutase	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, מסצ'וסטס, ארה"ב	A1105-01
אזמל סילוק סטרילי (מס' 15)	MedWare, Naples, ארצות הברית	120920
מזרקים 1 מ"ל	BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, ארה"ב	303172
מזרקים 10 מ"ל	BD Discardit II, בקטון דיקינסון, פרנקלין לייקס, ארה"ב	309110
צלוחיות תרבית תאים סטריליות T75	Sarstedt AG & Co., נומברכט, גרמניה	83,39,11,302