טכניקת צימוד אבידין-ביוטין להצגת אנטיגנים ממוקדים על Mycobacterium bovis BCG

תקציר

מקור: Liao, T. A., et al., <a href="https://app.jove.com/v/56421">ביטוי של אנטיגנים אקסוגניים בחיסון Mycobacterium bovis BCG באמצעות קישוט פני שטח לא גנטי עם מערכת אבידין-ביוטין. J. Vis. Exp. (2018).

הסרטון מדגים טכניקה לטעינת אנטיגנים על Mycobacterium bovis BCG כדי לשפר את התכונות האימונוגניות שלו. השיטה משתמשת במערכת אבידין-ביוטין כדי לצפות את פני השטח של החיידקים באנטיגנים אקסוגניים.

פרוטוקול

1. ביוטינילציה של פני השטח של תאי BCG

1. לגדל BCG בציר Middlebrook 7H9 עם 10% OADC (חומצה אולאית, אלבומין ותמיסת דקסטרוז) ו-0.05% טווין 80 ב-37°C על משטח שייקר ב-50 סל"ד עד OD = 0.5-1.
   הערה: BCG הוא פתוגן ברמת בטיחות ביולוגית 2 וכל הניסויים הנוגעים ל-BCG צריכים להיעשות בארון בטיחות ביולוגית עם ציוד מגן אישי מתאים.
2. יש לשטוף 10⁹ BCG 3 פעמים עם 500 μL של PBS נטול אנדוטוקסין קר כקרח בתוספת 0.1% Tween80 (PBST) (pH 8.0). יש להשהות את גלולת BCG ב-PBS סטרילי נטול אנדוטוקסין.
3. מיד לפני השימוש, להכין 1 מ"ל של 10 mM Sulfo-NHS SS biotin במים מסוננים סטריליים.​
   1. לדגור על חיידקים עם 1 מ"ל של 0.5 mM של Sulfo-NHS SS biotin בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
4. יש לשטוף את החיידקים המסומנים 3 פעמים עם 500 מיקרוליטר של PBST קר קר כדי להסיר מגיב ביוטינילציה שאינו מגיב.
   1. גלולה להשעות מחדש ב 1 מ"ל של PBST.

2. קשירה של חלבון אבידין-פיוז'ן מונומרי למשטח BCG ביוטינילציה

1. יש לערבב 5 x 10⁸ BCG ביוטינילציה עם חלבון אבי (10 מיקרוגרם/מ"ל סופי ב-PBS-T) במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על משטח שייקר.
2. לשטוף חיידקים 3 פעמים עם 500 μL של PBST קר קר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ללא אנדוטוקסין RPMI 1640	טכנולוגיות StemCell	36750
סולפו-NHS SS ביוטין	תרמו פישר	21328
מרק מידלברוק 7H9	מערכות אבחון BD	271310
OADC	מערכות אבחון BD	B11886
טווין 80	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 1379