בדיקה לניתוח בדיקת β-גלוקן כאסטרטגיה אימונותרפית נגד תאי סרטן המוח

תקציר

מקור: Folgado-Dorado, C. et al., בידוד וטיהור של β-גלוקן פטרייתי כאסטרטגיה אימונותרפית לגליובלסטומה. J. Vis. Exp. (2023)

סרטון זה מדגים בדיקה במבחנה המשתמשת ב-β-גלוקנים כדי להפעיל תאי מיקרוגליה לייצור רדיקלים סופראוקסידים, מין חמצן תגובתי. בתאי סרטן המוח, המחמצנים הריאקטיביים הנוצרים מדכאים באופן פעיל את התפשטות תאי הגידול וגורמים למוות תאי.

פרוטוקול

מחקר חוץ גופי של גירוי מיקרוגליה המושרה על ידי β-גלוקן

1. תרבית תאים של גליובלסטומה עכברית ותאי מיקרוגליה בשקופיות קאמריות בנות 8 בארות

הערה: פרוטוקול זה ספציפי לקווי תאים GL261 (גליובלסטומה) ו-BV2 (מיקרוגליה). עם זאת, עם שינויים קלים, צעדים אלה יכולים לשמש באופן פוטנציאלי לחקר סרטן אחרים וקווי תאים חיסוניים.

1. הכינו את המדיום השלם של Dulbecco (DMEM) עם L-גלוטמין, 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, וללא פירובט. הוסף 10% של סרום בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין. מחממים מראש את החומר באמבט מים ב 37 ° C במשך 15 דקות.
2. הפשירו את ה-BV2 וה-GL261 הקפואים לתוך אמבט מים (37°C) למשך 2 דקות, ורגע לפני שהם מפשירים לחלוטין, נשאו אותם לתוך מכסה מנוע של זרימה למינרית והכניסו את התאים לשתי צלוחיות T25 סטריליות שונות (אחת לכל קו תאים).
3. לדגור את צלוחיות T25 ב 37 ° C, 5% CO₂ עד התרבית הוא CONFLUENT.
   הערה: בהתאם לתנאי ההקפאה והזמן תחת הקפאה, הזמן עד למפגש עשוי להשתנות. קווי תאים אלה דורשים בדרך כלל בין 3 ל -5 ימים כדי להגיע למפגש בבקבוק T75.
4. לאחר שתרבית תאי BV2 הופכת למשתלבת, העבירו אותה לשקופיות תא 8 בארות 0.6 x 10⁶ תאים/ באר. שמור את שקופיות התא 8 בארות באינקובטור במשך 24 שעות.
5. לאחר שתאי מיקרוגליה מצופים לתוך שקופיות תא 8 בארות, חזור על אותו פרוטוקול עם תאי GL261.

2. הפעלת מיקרוגליה עם β-גלוקנים

1. צפו את תאי BV2 בארבעה β-גלוקנים שונים (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum ו-H. erinaceus) בריכוז של 0.2 מ"ג/מ"ל למשך 72 שעות. תנאי ניסוי אחד חייב להישאר לא מטופל (מדיום נורמלי), מתפקד כקבוצת ביקורת.
2. אוספים את הסופרנאטנט עם פיפטה לאחר 72 שעות ומעבירים את הנפח הנותר דרך מסנן מזרק 0.20 מיקרומטר. לאחר מכן, להקפיא את supernatant ב -80 ° C לפחות 24 שעות.

3. טיפול ב-GL261 בתווך מותנה במיקרוגליה מופעל מראש

1. ברגע שה-GL261 מתלכד ב-80% בתוך מגלשות תא 8 הקידוחים, יש להוסיף תווך מיקרוגליאלי β-גלוקן בריכוז נפח סופי של 25% למשך 72 שעות (נפח כולל: 250 מיקרוליטר/באר).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שקופיות קאמריות עם 8 בארות	Thermo Fisher, ארצות הברית	171080
מדיום הנשר של דולבקו, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	10564011
Extenda (α- עמילאז/גלוקועמילאז)	Novozymes, דנמרק
סרום בקר עוברי	Gibco, Life Technologies, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	A4736301
מלח חוצץ פוספט	Gibco, Life Technologies, קרלסבד, קליפורניה, ארה"ב (ארצות הברית)	1010-015
פניצילין/סטרפטומיצין	Sigma-Aldrich , סנט לואיס	עמ' 4458
אינקובטור	אפדורף	גלקסי 170S