שיטה לטיפול במלח גבוה בתאים דנדריטיים והעברתם המאומצת לעכברים

תקציר

מקור: Van Beusecum, J. P., et al. בידוד והעברה מאומצת של תאים דנדריטיים מציגי אנטיגן המטופלים במלח גבוה. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים הליך להעברה מאומצת של תאים דנדריטיים מציגי אנטיגן (DCs) המטופלים במלח גבוה לעכברים. תאים דנדריטיים מסוג Murine CD11c+ (DCs) נחשפים למדיום המכיל כמויות גבוהות של נתרן, ויוצרים בתאים איזולבוגלנדין (IsoLG)-חלבון adducts. אדדוקטים אלה משמשים ניאואנטיגנים ומוצגים על פני השטח של DCs. התאים המטופלים במלח מוזרקים לעכברים באמצעות העברת תאים מאומצת.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. בידוד הטחול מעכברים

1. הכן 1640 RPMI (מכון הזיכרון רוזוול פארק): 10% סרום בקר עוברי (FBS), 0.10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), 1 mM נתרן פירובט, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
2. הרדימו עכברים זכרים C57bl/6 בני 10-12 שבועות על ידי שאיפת CO₂. רססו את החזה ואת הצדדים של העכבר עם 70% אתנול. בצד שמאל, לפתוח בזהירות את העור ואת חלל הצפק כדי לחשוף את הטחול.
3. בעזרת מלקחיים קטנים, להזיז בזהירות את המעיים והכבד לצד שמאל של העכבר, ובאמצעות מספריים עדינים, בעדינות הבלו את הטחול.
   הערה: שלב זה חייב להיעשות בזהירות רבה, כמו נזק למערכת העיכול יכול לגרום לזיהום.
4. מניחים כל טחול נכרת בצינור חרוטי מסומן 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל של מדיום RPMI 1640.

2. יצירת מתלים חד-תאיים מטחול

הערה: ניתן לפרק את הטחול לתרחיף חד-תאי על ידי שילוב של דיסוציאציה מכנית עם עיכול אנזימטי.

1. הכן את תמיסת העיכול של הטחול על ידי הוספת collagenase D (1 מ"ג / מ"ל; 0.29 U / מ"ג lyophilized) ו- DNase I (0.1 מ"ג / מ"ל) מוכן RPMI 1640 בינוני (ראה שלב 1.1)
2. השתמש במלקחיים כדי להעביר את הטחול לתוך צינור C (צינור דיסוציאציה) המכיל 3 מ"ל של תמיסת עיכול הטחול.
3. בצע את הדיסוציאציה המכנית באמצעות הומוגנייזר חצי אוטומטי בהתאם להוראות היצרן.
   1. הניחו את צינור C על ההומוגנייזר החצי-אוטומטי, וודאו שצינור C ממוקם היטב על הזרוע המסתובבת. לאחר מיקום צינור C, לחץ על לחצן התחל בהומוגנייזר האוטומטי למחצה כדי להפעיל את פרוטוקול הטחול 04.01 עבור 60 s.
      הערה: דיסוציאציה מכנית יכולה להתבצע גם על ידי הנחת מסנן 40 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי 50 מ"ל וטחינה עדינה של הטחול דרך המסנן. לאחר השחזת הטחול, באמצעות שטיפת מסנן 40 מיקרומטר עם 10 מ"ל של מדיה RPMI.
4. לאחר דיסוציאציה מכנית, לנתק את הצינור מן homogenizer ולבצע את העיכול האנזימטי. דגרו על הדגימות במשך 15 דקות ב-37°C תחת סיבוב רציף (20 סל"ד).
5. מעבירים את התמיסה על ידי הפיכתה לצינור חרוטי של 50 מ"ל לאחר סינון דרך מסננת של 40 מיקרומטר. שטפו את המסננת בגודל 40 מיקרומטר עם 10 מ"ל של PBS (dPBS) של Dulbecco. צנטריפוגה את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
6. לאחר הצנטריפוגה, שאפו את הסופרנאטנט לחלוטין ושטפו את הגלולה על ידי השעייתו מחדש ב -10 מ"ל של dPBS. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.

3. בידוד DCs ^CD11c+ מתרחיף תא בודד ספלני

1. להשעות מחדש את גלולת התא ב 5 מ"ל של dPBS ולספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer ו טריפאן כחול exclusion.
2. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 300 x גרם, במשך 10 דקות ב 4 ° C.
3. שאפו את הסופרנאטנט לחלוטין והשהו מחדש את הגלולה ב-400 מיקרוליטר של מאגר מיון תאים מופעל מגנטית (MACs).
4. הוסף 100 μL של microbeads CD11c (ראה טבלה של חומרים) לכל 1 x 10⁸ תאים.
5. מערבבים את תרחיף התא ודגרים במשך 10 דקות במקרר ב 4 מעלות צלזיוס.
6. הוסף 10 מ"ל של מאגר MACs כדי לשטוף תאים. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C.
7. שאפו את הסופרנאטנט לחלוטין והשהו מחדש במאגר של 500 מיקרוליטר של MACs.

4. הפרדה מגנטית של CD11c⁺ DCs

הערה: ההפרדה המגנטית מתבצעת באופן ידני באמצעות מפריד מגנטי (ראה טבלת חומרים) המצויד בעמודי LS. הפרדה מגנטית יכולה להיעשות גם באופן אוטומטי באמצעות מפריד מגנטי אוטומטי. (ראה טבלת חומרים).

1. מקם את עמודת LS בשדה המגנטי של מפריד MACs וצינור חרוטי של 15 מ"ל מתחת לכל עמודה כדי לאסוף את הזרימה.
2. שטוף את עמוד LS עם 3 מ"ל של חיץ.
3. הנח את מתלה התא על כל עמודת LS ואסוף את הזרימה המכילה תאים ללא תווית.
4. שטפו את עמודת ה-LS עם 3 מ"ל של מאגר MACs, ואספו את התאים הלא מסומנים שעוברים דרכם. שטפו את עמוד ה-LS 2 פעמים נוספות.
5. הסר את עמודת LS מהמפריד המגנטי. הוסף 5 מ"ל של מאגר MACs לכל עמודה ושטוף מיד את התאים המסומנים מגנטית על ידי צלילה בחוזקה של עמודת LS לתוך צינור חרוטי נקי של 15 מ"ל.
   הערה: חשוב לבצע בידוד כפול של תאי CD11c כדי להשיג השעיית תאים ברמת טוהר גבוהה. לכן, חזור על שלבים 3.1 עד 4.5. והפניה לאיור 4 לתקני טוהר. שלב זה משפר את הטוהר של תאי CD11c ⁺ ל 90-95%.
6. קבע את מספר CD11c ⁺ DC על המוציטומטר באמצעות אי הכללת כחול טריפאן. לדלל את דגימת התא בדילול של 1:1 בתמיסת טריפאן כחולה 0.4%.
   הערה: תאים שאינם בני קיימא יוכתמו בכחול, בעוד שתאים בני קיימא יישארו ללא כתמים.
   1. כדי לעשות זאת, בזהירות למלא hemocytometer עם 10 μL של דילול מדגם התא לדגור במשך דקה 1.
   2. ספירת תאים ב- 4 ריבועים של 1 x 1 מ"מ² בתא שנטען כדי לקבוע את מספר התא הבר-קיימא.

5. טיפול מלח גבוה במבחנה של CD11c⁺ DCs

1. הכן מדיום תרבית DC על ידי הוספת 10% FBS, 0.1 mM HEPES, 1 mM נתרן פירובט, 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין ל 500 מ"ל 1640 סל"ד.
2. הכינו מדיה של תרבית תאי מלח גבוהה 10x DC (400 mM) על ידי שקילת 1.17 גרם של NaCl והכנסתו לצינור בז סטרילי של 50 מ"ל. הוסף 50 מ"ל של מדיה סטרילית של תרבית תאי DC (שהוכנה בשלב 5.1) לצינור הבז והמערבולת של 50 מ"ל עד שה- NaCl נמצא בתמיסה.
3. סנן מיד את מדיית תרבית DC עתירת המלח באמצעות סינון ואקום דרך מסנן 0.2 מיקרומטר במכסה מנוע של תרבית תאים.
4. צנטריפוגה כל תא מתלה מהטחול ב 300 x גרם למשך 10 דקות ב 4ºC. להשהות מחדש כל כדורית תא במדיה תרבית DC בריכוז של 1 x 10⁶ תאים / מ"ל.
5. פיפטה 900 μL (בערך 1 x 10⁶ תאים) של מתלה DC בלוח פלקון תחתון שטוח 24 בארות. הוסף 100 μL של מצע תרבית DC עתיר מלח לכל באר לקבלת ריכוז נתרן סופי של 190 mM. תייגו את הצלחת והניחו באינקובטור CO₂ לח בטמפרטורה של 37°C למשך 48 שעות.

6. העברה מאמצת של DCs CD11c⁺ המטופלים במלח גבוה

1. לאחר גירוי חוץ גופי במשך 48 שעות, להסיר את הצלחת מן 37 ° C לחות CO₂ אינקובטור.
2. פיפטה את מדיה תרבית התא למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש את CD11c ⁺ DCs. פיפטה כל CD11c ⁺ DC השעיה לתוך צינור מסומן תואם 1.6 מ"ל. חזור על שלב זה עבור כל אדם מצופה היטב.
3. צנטריפוגה כל מתלה CD11c ⁺ DC ב 300 x גרם למשך 10 דקות ב 4 ° C. שאפו את הסופרנטנט. השהה מחדש את גלולת DC עם 100 μL של dPBS סטרילי.
4. משוך מתלה DC לתוך מזרק 1 מ"ל מצויד מחט 27 G 1/2 אינץ '.
5. הניחו את עכברי C57bl/6 הזכרים התמימים בני 10 שבועות תחת 2% איזופלורן כדי להשיג מישור כירורגי יציב. בדוק את רמת ההרדמה עם חוסר רפלקס הדוושה. לאחר השגת מישור כירורגי יציב, הכניסו את המחט לאט ובזהירות לחלל הרטרו-מסלולי, בזווית של כ-30°
   הערה: השיפוע של מחט 27 G צריך להצביע כלפי מטה, הרחק מהעין, כדי למנוע נזק עיני.
הזריקו
6. לאט ובצורה חלקה את מתלה CD11c ⁺ DC (בערך 1 x 10⁶ תאים). לאחר השלמת ההזרקה, הסר בזהירות את המחט מהחלל הרטרו-אורביטלי כשהוא מודע שלא לפגוע בעין.
   הערה: לאחר ההזרקה, צריך להיות מעט או ללא דימום. העברה מאמצת של CD11c ⁺ DCs יכולה להתבצע גם בשיטת I.V. של הזרקה (למשל וריד זנב). עכברי הביקורת קיבלו CD11c⁺ DCs שגודלו בתרבית במצעי מלח רגילים.
7. הסר את העכברים מחרוט האף ועקוב אחריהם במשך כ -30 דקות במהלך ההתאוששות מהרדמה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
APC/Cy7 נגד עכבר CD11c	ביואגדה	117324
מאגר הפעלה autoMACS	Miltenyi ביוטק	130-091-221
CD11c MicroBeads Ultrapure	Miltenyi ביוטק	130-108-338
קולגנאז D	רוש	11088866001
DNase I	רוש	10104159001
dPBS ללא סידן ומגנזיום	קורנינג	21-031-CV
מגיב חסימת FcR	Miltenyi ביוטק	130-092-575
FITC נגד עכבר CD45	ביואגדה	103108
צינור GentleMACS C	Miltenyi ביוטק	130-096-334
התקן דיסוצייאטור GentleMACS	Miltenyi ביוטק	130-093-235	פרוטוקול שימוש: טחול 04.01
LIVE/DEAD ערכת כתמים של תאים מתים סגולים הניתנים לתיקון	Invitrogen	L34964
עמודות LS	Miltenyi ביוטק	130-042-401
מפריד QuadroMACs	Miltenyi ביוטק	130-090-976
סל"ד 1640 בינוני	גיבקו	11835-030